हम उप नैनोमीटर संकल्प छवियों आयाम मॉडुलन (दोहन मोड) तरल में परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त करने के लिए एक तरीका मौजूद है। विधि वाणिज्यिक परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी पर प्रदर्शन किया है। हम मानकों की हमारी पसंद के पीछे तर्क समझाने और संकल्प अनुकूलन के लिए रणनीति का सुझाव।
Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user’s specific system.
अपने आविष्कार के बाद से, तीन दशक पहले परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 1 से ही पसंद का एक तकनीक के रूप में नैनो पैमाने पर नमूनों की जांच के लिए स्थापित किया है, विशेष रूप से जहां स्थूल सतह क्षेत्रों से अधिक औसत संभव नहीं है और स्थानीय जानकारी आवश्यक है। एक ठेठ AFM माप में, एक लचीला ब्रैकट के विक्षेपन अणुओं की एक छोटी संख्या है और एक UltraSharp टिप ब्रैकट के अंत में घुड़सवार के बीच बातचीत बल यों इस्तेमाल किया जाता है। बातचीत के प्रकार और timescales माना जाता है पर निर्भर करता है, के बारे में जानकारी की एक विस्तृत श्रृंखला मुलायम जैविक झिल्लियों 2,3 के viscoelastic संपत्तियों सहित, प्राप्त किया जा सकता है, एक ही रासायनिक की ताकत या आणविक बांड 4,5, एक की atomistic विवरण सतह 6 – 8, चुंबकीय 9, कैपेसिटिव 10, 11, 12,13 थर्मल और रासायनिक 14 नमूने के गुणों का आयोजन <sup> 15। AFM की सफलता का हिस्सा है, सामग्री 16 वर्ष की एक विस्तृत श्रृंखला पर और इस तरह के वैक्यूम 17, 11,18 गैस या तरल 19,20 के रूप में कई वातावरण में काम करने की क्षमता है क्योंकि यह जांच और नमूना के बीच एक विशिष्ट बल पर भरोसा नहीं करता ।
अभ्यास में, तथापि, परिवेश के अलावा अन्य स्थितियों में AFM ऑपरेटिंग चुनौतीपूर्ण और कई प्रकाशित परिणाम अभी भी हवा में प्राप्त कर रहे हैं हो सकता है। एक जोड़ा कठिनाई तथ्य यह है कि यह आम तौर पर आदेश बड़े घर्षण बलों से बचने के द्वारा दोनों टिप और नमूना बनाए रखने के लिए गतिशील मोड (हिल टिप) में AFM संचालित करने के लिए आवश्यक है से आता है। हालांकि अधिक चुनौतीपूर्ण है, गतिशील आपरेशन सिद्धांत में नमूना विश्लेषण किया बारे में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं और स्थानिक संकल्प का कोई नुकसान के साथ कर सकते हैं। बहु माप करने के लिए, 23 – पिछले दशक के दौरान, तरल में गतिशील AFM के क्षेत्र महत्वपूर्ण घटनाक्रम देखा गया वीडियो दर AFM 21 के आगमन से, <sup> इंटरफेस 26 पर हाइड्रेशन संरचनाओं के 24,25 और उप नैनोमीटर इमेजिंग – 31। 36, बहुलक अनुसंधान 37, electrochemistry 38 – – 40 और ठोस तरल इंटरफेस लक्षण वर्णन 41 – 44 AFM आपरेशन जबकि तरल में डूब अब नियमित रूप से जीव विज्ञान और बायोफिज़िक्स 32 में प्रयोग किया जाता है। हिल ब्रैकट के आसपास तरल की उपस्थिति काफी अपनी गतिशीलता 45 के रूप में अच्छी तरह से टिप और नमूना 29,42 के बीच बातचीत बदल। जब उचित इस्तेमाल, तरल सबसे अच्छा समाधान परिवेश की स्थिति 46 में हासिल की तुलना में परिमाण के लगभग एक आदेश का एक विशिष्ट सुधार के साथ, इमेजिंग संकल्प 26,29 को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
AFM में, उच्चतम स्थानिक संकल्प एक विशेष माप के लिए प्राप्त दोनों AFM खुद की गुणवत्ता और टी की प्रकृति पर निर्भर करता हैवह बातचीत 20,47,48 की जांच की। वर्तमान समय में, सबसे उच्च अंत, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा वर्तमान शोर का स्तर है कि थर्मल सीमा 12 के करीब रहे हैं तो समाधान के लिए निर्धारित कारक आमतौर पर टिप नमूना बातचीत है। इसे प्रभावी ढंग से इस बातचीत के प्रस्ताव निर्धारित करता है कि स्थानिक ढाल है: कम दूरी के आधार पर तेजी से बातचीत खस्ताहाल माप से जब लंबी दूरी बातचीत खेलने पर हैं उच्च संकल्प परिणाम का उत्पादन। तरल में, क्योंकि वे तरल के केवल कुछ ही आणविक व्यास भर में गायब हो जाते हैं solvation बलों इमेजिंग संकल्प में सुधार कर सकते हैं (आम तौर पर <1 एनएम) जब नमूना 49 की सतह से दूर जा रहा है। इन बलों तरल अणुओं और नमूना की सतह के बीच बातचीत से उत्पन्न। सतह के लिए एक मजबूत संबंध के साथ एक तरल अधिक का आदेश दिया और नमूना 29,42,50 के साथ इंटरफेस में थोक तरल से कम मोबाइल हो जाते हैं जाएगा। नतीजतन,यह एक हिल AFM टिप के लिए अधिक ऊर्जा लेने से थोक तरल 42 इंटरफेसियल तरल अणुओं विस्थापित करने के लिए, माप प्रतिपादन अत्यधिक nanoscale -इस solvation परिदृश्य पर इंटरफेसियल तरल गुणों में स्थानीय रूपांतरों के प्रति संवेदनशील होगा।
आदेश solvation बलों का दोहन करने के लिए, कई व्यावहारिक पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, टिप के दोलन आयाम solvation बलों की सीमा के बराबर हो जाने की जरूरत है, आम तौर पर 1 एनएम <। दूसरा, तरल इस्तेमाल नमूना की सतह पर एक अच्छी तरह से परिभाषित solvation परिदृश्य फार्म चाहिए। Macroscopically, यह नमूना माना जाता है के लिए एक 'गीला' तरल की आवश्यकता के बराबर है। उदाहरण के लिए, पानी में हाइड्रोफोबिक ग्रेफाइट 42,51 पर से हाइड्रोफिलिक अभ्रक पर आणविक स्तर के संकल्प को प्राप्त करने के लिए आसान है। अंत में, ब्रैकट टिप का समर्थन करने का लगातार वसंत उचित रूप से 52,53 चयनित किया जाना चाहिए। जब इन चुनाव में कामditions, AFM केवल इंटरफ़ेस की आणविक स्तर छवियों प्रदान नहीं करता है, लेकिन यह भी स्थानीय नमूना तरल आत्मीयता के जो नमूना की सतह के बारे में 54 रासायनिक जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बारे में जानकारी प्राप्त कर लेता है।
सबसे आम गतिशील तरल में AFM के लिए आपरेशन के मोड आयाम मॉडुलन (एएम भी 'मोड दोहन') AFM और आवृत्ति मॉडुलन (एफएम) AFM हैं। पहला मामला 55 में, टिप नमूना रेखापुंज-स्कैन करता है, जबकि इसकी कंपन आयाम एक राय पाश है कि लगातार फिर से समायोजित कर देता है टिप नमूना दूरी के अनुसार स्थिर रखा है। नमूने के एक स्थलाकृतिक छवि सुधार प्रतिक्रिया पाश द्वारा लागू से प्राप्त की है। एफएम-AFM 28,41,56 में, यह ब्रैकट / टिप है कि स्थिर रखा है जबकि टिप नमूना स्कैन के दोलन आवृत्ति है। दोनों तकनीकों तरल 36,57 में तुलनीय स्थलाकृतिक संकल्प प्रदान करते हैं। टिप नमूना बातचीत की मात्रा अधिक strai हो जाता हैghtforward और एफएम-AFM में सही है, लेकिन AM-AFM और अधिक मजबूत लागू करने के लिए आसान है, और नरम cantilevers, कुछ आसानी से विरूप्य या नाजुक नमूनों के अध्ययन के लिए उपयोगी के साथ काम करने की अनुमति देता है। गौरतलब है कि AM-AFM आंशिक रूप से ऐतिहासिक कारणों के लिए, लेकिन यह भी सच है कि यह तकनीकी रूप से नियंत्रित करने के लिए आसान है कि के कारण, AFM उपयोगकर्ताओं के बीच और अधिक व्यापक है।
हालांकि आयाम AM-AFM इमेजिंग के दौरान प्रतिक्रिया पाश से स्थिर रखा है, टिप दोलन दोलन और ड्राइविंग के बीच चरण अंतराल स्वतंत्र रूप से बदलने के लिए अनुमति दी है। चरण अंतराल टिप नमूना बातचीत के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं, ऊर्जा नमूना 58 के साथ इंटरफेस में टिप के दोलन के दौरान व्यस्त से संबंधित जा रहा है। इसलिए पहले चरण इमेजिंग स्थलाकृतिक इमेजिंग के लिए एक साथ प्राप्त किया जा सकता है, और अक्सर एक नमूना की सतह की विविधता पर प्रकाश डाला में पूरक है। चरण इमेजिंग बातचीत के विभिन्न मानचित्रण, Di सहित के लिए उपयोग किया गया हैआसंजन ऊर्जा 42, viscoelastic गुण 58 और एक इंटरफेस 44 के हाइड्रेशन परिदृश्य के रंगरूट मानचित्रण।
व्यावहारिक रूप से, तरल में उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के मानकों को नियंत्रित करने की बड़ी संख्या है, और एक सरल, व्यवस्थित प्रोटोकॉल है कि हर स्थिति में काम करता है के अभाव के कारण गैर तुच्छ बनी हुई है। छवि गुणवत्ता आम तौर पर ब्रैकट ज्यामिति और लोच, टिप रसायन विज्ञान, दोलन आयाम, और नमूना कठोरता, दूसरों के बीच में 55 निर्भर करता है। AFM माप भी कर रहे हैं, परिभाषा से, व्यवस्था करने के लिए perturbative। नतीजतन, उचित विचार के बिना इमेजिंग चर और पर्यावरण की स्थिति को बदलने के reproducibility और / या misrepresentative टिप्पणियों और नकली परिणामों में कठिनाई हो सकती है।
यहाँ, हम समाधान में हार्ड और सॉफ्ट नमूनों की उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल मौजूद है, ampl में संचालित व्यावसायिक उपकरणों का उपयोगitude मॉडुलन। हमारा लक्ष्य मुख्य मापदंडों विभिन्न नमूनों से अधिक संकल्प को प्रभावित करने की संभावना के अनुकूलन, प्रत्येक मामले में इमेजिंग प्रक्रिया अंतर्निहित भौतिक सिद्धांतों से हमारी पसंद के लिए तर्क समझाने के लिए एक व्यावहारिक प्रक्रिया का प्रस्ताव है। हम विस्तार से एक कदम-दर-कदम दृष्टिकोण, सब्सट्रेट सफाई और तैयारी से, इमेजिंग मापदंडों के ब्रैकट की पसंद है, समायोजन और आम समस्याओं के निवारण के लिए। उच्च संकल्प के लिए हमारी पसंद और प्रक्रियाओं के पीछे वैज्ञानिक तर्क समझाते हुए तर्कसंगत विकल्प बनाने जब कार्यप्रणाली अनुकूल ढालने में मदद, और इमेजिंग उपन्यास प्रणालियों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करना चाहिए।
इस पाठ के दौरान हम AM एक AFM के आयाम मॉडुलन ऑपरेशन मोड का उल्लेख करने का उपयोग करें। हम रखा निरंतर या तो ब्रैकट विक्षेपन (संपर्क मोड) या setpoint मूल्य के रूप में दोलन आयाम (AM मोड) के दौरान प्रतिक्रिया पैरामीटर को देखें। AM मोड में, ब्रैकट बाहर से संचालित हैया तो एक ध्वनिक दोलन द्वारा या एक स्पंदित लेजर द्वारा ब्रैकट के आधार पर ध्यान केंद्रित किया। ड्राइव आयाम बाहरी oscillatory संकेत की तीव्रता है। ड्राइव ब्रैकट का एक दिया दोलन आयाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक आयाम के निरपेक्ष मूल्य इस तरह के (कठोरता, ज्यामिति) ड्राइविंग की विधि (ध्वनिक, photothermal या चुंबकीय), ब्रैकट निर्धारण और मानकों और लेजर संरेखण के रूप में कई मापदंडों पर निर्भर करता है। ड्राइव आयाम का सही मूल्य इसलिए प्रासंगिक नहीं है बल्कि यह एक प्रयोग में निकाला जाता है तो के रूप में ब्रैकट का एक उचित (और मात्रात्मक) दोलन आयाम प्रदान करने के लिए। जब संचालित ब्रैकट दूर नमूना से दूर है और इसका कंपन का कोई भिगोना टिप नमूना बातचीत के माध्यम से होता है, इसका दोलन आयाम मुक्त दोलन आयाम कहा जाता है। हिल टिप नमूना की सतह nears के रूप में, उसके आयाम को कम करने के लिए शुरू होता है। प्रतिक्रिया सक्षम है, तो जेड पीजो const होगाताकि चयनित setpoint आयाम उलटना करने के लिए, निरंतर antly इसके विस्तार को फिर से समायोजित करें। setpoint मूल्य सामान्य रूप से हमेशा मुक्त आयाम की तुलना में छोटा होता है। यह नि: शुल्क आयाम खत्म setpoint अनुपात, setpoint आयाम का अनुपात (इमेजिंग आयाम) का उल्लेख करने के लिए आम है। छोटे setpoint अनुपात, कठोर इमेजिंग शर्तों रहे हैं।
यह मानते हुए कि इमेजिंग तरल और ब्रैकट कठोरता उचित रूप से चुना गया है, सफल उच्च संकल्प को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम इमेजिंग आयाम का समायोजन, और इस प्रणाली की जांच के समग्र साफ-सफाई कर रहे हैं।
इंटरफेसियल तरल क्षेत्र (आम तौर पर कम से कम 2 एनएम) की मोटाई के लिए तुलनीय आयाम मुख्य रूप से इंटरफेसियल विलायक 42 के गुणों में भिन्नता जांच। अगर दोलन आयाम बहुत बड़ी है, हिल टिप लंबी दूरी, गैर रेखीय बल क्षेत्रों 52 कि ब्रैकट गति की स्थिरता को रोकता है, और अनिवार्य रूप से इमेजिंग शर्तों 29 की परवाह किए बिना नमूना मारा, संकल्प की गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप पार करेंगे। संकल्प में नुकसान के अलावा, उच्च harmonics टिप गति में प्रकट करने के लिए शुरू करते हैं और प्रणाली 55 मॉडल करने के लिए और अधिक जटिल हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, बहुत छोटा है, तो इमेजिंग आयाम है ओइंटरफ़ेस की nly हिस्सा (इंटरफेसियल तरल के आम तौर पर विशिष्ट परतों) की जांच की जाती है और स्थिर इमेजिंग केवल कड़ी cantilevers के साथ प्राप्त किया जा सकता है एक संतोषजनक संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए (> 10 एन / पानी के 53 में मीटर), के जोखिम के साथ बड़ी ऊंचाई रूपों से ज्यादा हानिकारक नरम नमूने हैं। कड़ी cantilevers के लिए जरूरत थर्मल शोर है कि अधिक महत्वपूर्ण है कि संकेत मापा जब छोटे आयाम के साथ काम करना, टिप और नमूना के बीच लंबी दूरी की बातचीत अभी भी मौजूद हैं, लेकिन मोटे तौर पर लगातार कर रहे हैं और प्रभावित नहीं करते हो सकता है पर काबू पाने के लिए है प्राप्त छवियों में उच्च संकल्प इसके विपरीत।
इमेजिंग के वातावरण की सफाई सर्वोपरि महत्व का है जब यह उच्च संकल्प AFM के लिए आता है। प्रणाली में अवांछित यौगिकों दोनों इमेजिंग और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। वहाँ संदूषण के दो मुख्य श्रेणियों कि प्रयोगों को प्रभावित करने के लिए करते हैं: जब इमेजिंग (i) दूषित पदार्थों को सीधे दिखाई ( <stroएनजी> चित्रा 4 बी, 4C) और (ii) उच्च संकल्प के सामान्य अस्पष्टीकृत कमी है। प्रकरण (i) केवल इस तरह के पानी अभ्रक इंटरफेस जहां adsorbed आणविक समुच्चय है कि टिप नमूना बातचीत के साथ हस्तक्षेप स्पष्ट रूप से atomically फ्लैट अभ्रक सतह (चित्रा -4 ए) के खिलाफ विपरीत कर रहे हैं पर के रूप में अत्यधिक आर्दश सिस्टम में हो जाता है। टिप और नमूना बदलने से पहले, यह एक बड़ी विक्षेपन के साथ स्पेक्ट्रोस्कोपी घटता प्राप्त प्रभावी रूप से कठिन नमूना के खिलाफ टिप बार बार दबाने के लायक है। यह सामान्य रूप से एक नए सिरे नुकसान होगा, लेकिन कभी कभी एक गंदा टिप साफ या इमेजिंग के लिए उपयुक्त स्थिर हाइड्रेशन साइटों के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इस टिप, हालांकि, अनिवार्य रूप से पा लिया जाएगा और इसलिए भले ही इमेजिंग में सुधार फ्लैट नमूना के लिए ही उपयुक्त हो। कड़ी नमूने भर में संदिग्ध प्रदूषण के मामले में, यह कुछ हद तक विनाशकारी ऊपर वर्णित प्रक्रिया प्रयास करने से पहले ब्रैकट के दूसरे eigenmode के साथ छवि के लिए कोशिश कर रहा लायक हो सकता है। यह बस दप की आवश्यकता हैदूसरी eigenmode के लिए ड्राइविंग आवृत्ति खुजली और आयाम / setpoint (नीचे निवारण चर्चा देखें) readjusting। ब्रैकट बढ़ जाती है काफी जब दूसरी eigenmode पर संचालित है और किसी भी कमजोर adsorbed दूषित पदार्थों को टिप जबकि इमेजिंग द्वारा दूर धकेल दिया जा सकता है की प्रभावी कठोरता। इस रणनीति के लिए एक साफ नमूना और टिप के लिए जगह की जरूरत नहीं है, लेकिन एक टिप / नमूना स्पष्ट रूप से आदर्श नहीं है जब संतोषजनक छवियों को प्राप्त करने के लिए कुछ और आगे अवसर प्रदान करता है।
चित्रा 4: मनाया रूसी अभ्रक जब इमेजिंग संदूषण के उदाहरण है कि उच्च संकल्प इमेजिंग रोकना। एक: मीका 5 मिमी RbCl में imaged – कोई प्रदूषक कणों दिखाई दे रहे हैं। बी: संदूषण जबकि नाममात्र ultrapure पानी में इमेजिंग भर एनएम के दसियों के आदेश का समुच्चय का रूप ले। सी: आत्म इकट्ठे दूषित द्वारा गठित संरचनाओंNant कणों प्रकृति में शायद amphiphilic। इमेजिंग फिर नाममात्र ultrapure पानी में आयोजित किया गया। डी: लंबवत ऑफसेट वर्गों ए, बी और सी में धराशायी लाइनों अभ्रक के atomically फ्लैट सतह से विचलन illustrating के लिए इसी। ए, बी और सी में स्केल सलाखों 300 एनएम के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
प्रकरण (ii) अधिक आम और निराशा तथ्य यह है कि उप नैनोमीटर सुविधाओं बस, हल नहीं किया जा सकता है इमेजिंग की स्थिति की परवाह किए बिना द्वारा मुख्य रूप से होती है। इस प्रकार की स्थिति के हस्ताक्षर आमतौर पर बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप जो कुछ विसंगतियां दिखाई देते हैं में दिख रहा है। ये खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घटता है और आयाम बनाम दूरी घटता उल्लेखनीय है कि एक विशिष्ट sigmoidal आकार 42 से विचलित शामिल हो सकते हैं। contaminants, आयनिक या अन्यथा हैं, तो dispers हैंएड समान रूप से तरल पदार्थ भर में, वे नहीं स्थलाकृतिक इमेजिंग में दिखाई दे सकते हैं, लेकिन नमूना 69 है, जो एक नियमित रूप से टिप नमूना बातचीत 29 को बनाए रखने और उच्च संकल्प 70 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है की हाइड्रेशन संरचना को बाधित कर सकता है। वहाँ भी नमूना पर प्रदूषणों से प्रत्यक्ष प्रभाव, विशेष रूप से नरम, जैविक प्रयोगों में हो सकता है। उदाहरण के लिए, यह सर्वविदित है कि एल्कोहल की उपस्थिति (सफाई प्रक्रिया से) जेल चरण लिपिड bilayers fluidify कर सकते हैं 71 – 73, प्रतिपादन उप नैनोमीटर स्तर संकल्प असंभव है। उच्च संकल्प संभव नहीं है, तो ख्याल सबसे पहले, सफाई की प्रक्रिया में लिया जाना चाहिए किसी भी उपकरण है कि इमेजिंग समाधान के साथ संपर्क में आता है पर विशेष रूप से ध्यान दे। अगर पूरी तरह ठीक नहीं किया यहां तक कि ऐसे epoxy राल के रूप में जाहिरा तौर पर स्थिर यौगिकों कुछ हद तक तरल पदार्थ में solvate सकता है।
AM-AFM के साथ उच्च संकल्प इमेजिंग, की मांग की है और धैर्य की आवश्यकता हैसबसे अच्छा संभव इमेजिंग की स्थिति तक पहुँचने से पहले अक्सर कई परीक्षणों। छोटे प्रयोगात्मक मुद्दों को आसानी से काफी महत्वपूर्ण बन सकता है उच्च संकल्प और समस्या निवारण कौशल आवश्यक हैं रोकने के लिए। इसके बाद हम सबसे आम समस्याओं को हम अपने प्रस्तावित समाधान के साथ सामना करना पड़ा से कुछ की सूची।
ब्रैकट ट्यूनिंग
सबसे वाणिज्यिक सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा ध्वनिक उत्तेजना का उपयोग ब्रैकट ड्राइव करने के लिए। ऐसे मामले में, कदम 5.4 में वर्णित के रूप में, ब्रैकट ट्यूनिंग, के पास अपनी गुंजयमान आवृत्ति अक्सर हवा में ऑपरेशन के लिए पर्याप्त प्रदर्शन प्रदान करता है। तरल वातावरण में, तरल ऐसे ब्रैकट चिप और धारक के रूप में AFM के विभिन्न यांत्रिक भागों के बीच कुछ युग्मन के लिए प्रेरित करने के लिए जाता है। इस ब्रैकट के स्पष्ट गूंज, अक्सर एक ब्रैकट आवृत्ति स्पेक्ट्रम है कि कई तेज चोटियों और घाटियों सामान्यतः एक "चोटियों के वन" के रूप में वर्णित दर्शाती से यह साफ प्रभावित कर सकते हैं। नतीजतन, यह अक्सर Corre खोजना मुश्किल हैसीटी ड्राइव आवृत्ति। इन चोटियों भी गैस वातावरण में मौजूद हैं, लेकिन ब्रैकट की गुणवत्ता कारक के उच्च मूल्य की वजह से, अनुनादों पर आयाम काफी बड़ा 74,75 है। तरल में ब्रैकट ड्राइव करने के लिए उचित चोटी का चयन करना आसान नहीं होगा और परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता होती है सकते हैं। अभ्यास में, "चोटियों के वन" अनुनाद आवृत्ति के आसपास में आयाम में तेज बदलाव के साथ आवृत्ति चोटी आमतौर पर गूंज पर है और अक्सर एक ड्राइविंग आवृत्ति उच्च संकल्प इमेजिंग प्राप्त करने के लिए पर्याप्त प्रदान करता है बिल्कुल जरूरी नहीं होने के बावजूद सबसे अच्छा शर्त है।
छवि विरूपण
इमेजिंग बहाव अक्सर एक मुद्दा है जब उच्च संकल्प की मांग है और बनाता है छवियों विकृत (आमतौर पर फैला) देखो। इसके मूल में आम तौर पर थर्मल है, या तो (जैसे, एल्कोहल में इमेजिंग स्कैनर क्योंकि / AFM अपने संतुलन ऑपरेटिंग तापमान तक पहुँच नहीं है, क्योंकि या नमूना तरल का हिस्सा तेजी से evaporating है )। सभी मामलों में, बहाव थर्मल संतुलन में नगण्य हो जाता है। यह नमूना यदि संभव हो तो के तापमान को ठीक करने के लिए इसलिए उपयोगी है। अन्यथा, यह प्रयोग आयोजित करने से पहले कई घंटे के लिए (धीमी दर स्कैन में बड़े आकार स्कैन) एक खाली नमूना स्कैन करने के लिए AFM छोड़ने के लायक है। तो वाष्पीकरण एक मुद्दा नहीं है, इस प्रक्रिया के लिए सबसे अच्छा प्रक्रिया के 6 कदम के बाद किया जाता है, देखभाल करने के लिए पहली टिप सतह से एक कम दूरी (जैसे, 20 माइक्रोन) वापस लेने के लिए। कभी कभी, बहाव व्यापक thermalization के बाद भी रहेगा। यह आमतौर पर इंगित करता है कि ब्रैकट या उसके चिप आंशिक रूप से नमूना खींच रहा है, जबकि इमेजिंग, कुछ है कि इस तरह की फिल्मों पतली के रूप में या यदि टिप / ब्रैकट / चिप को उपयुक्त नहीं रखा गया है मुलायम एकजुट नमूनों पर भी हो सकता है। चिप्स है कि मेजबान एक से अधिक ब्रैकट / टिप, यह अक्सर मददगार ब्रैकट कि उपयोग में नहीं हैं बल्कि उन्हें सतह पर खींच तोड़ने के लिए है पर।
ईओण का शक्ति
ntent "> चूंकि इमेजिंग इंटरफेसियल तरल का प्रभुत्व है, यह पानी में आरोप लगाया सतह के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए कुछ नमक जोड़ने के लिए कभी कभी उपयोगी है। नमक की भूमिका दुगना है। सबसे पहले, यह की हाइड्रेशन परिदृश्य को संशोधित सतह सोखना, जो अक्सर विपरीत बढ़ाता पर imaged। दूसरे, यह टिप और नमूना के बीच स्क्रीन मजबूत electrostatic बातचीत में मदद करता है (जैसे, अभ्रक पर)। आम तौर पर, बड़ा आयनों जैसे पोटेशियम, रूबिडीयाम और सीज़ियम उनकी विशिष्ट हाइड्रेशन गुणों के कारण बेहतर छवियों की अनुमति देते हैं 76, और तथ्य यह है कि वे अक्सर एक अद्वितीय हाइड्रेशन राज्य में मुख्य रूप से 77 सोखना।बुरा ब्रैकट / टिप
यह (ऊपर वर्णित लक्षण देखें) संदिग्ध है कि ब्रैकट प्रदूषण का एक स्रोत है, यह पहली बार एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण किया जाना चाहिए। अगर एक जेल बॉक्स में संग्रहीत, ब्रैकट जेल पॉलिमर या सिलिकॉन तेल 59 कि प्रकट कर सकते हैं के निशान उठा सकते हैं, कई मामलों में, गहरे रंग के धब्बे के रूप में, (चित्रा 5 ए के रूप में) ब्रैकट की पीठ पर। ब्रैकट के Photothermal दोलन समान धब्बे पैदा कर सकते हैं, लेकिन वे गाड़ी चला लेजर द्वारा ब्रैकट कोटिंग की गिरावट / overheating के कारण कर रहे हैं। संदूषण ब्रैकट पर बेतरतीब ढंग से प्रकट होता जाता है। isopropanol और, फिर साथ एक लंबे समय (12 घंटे) सफाई, ultrapure पानी के साथ ब्रैकट से किसी भी अवांछित कणों को दूर कर सकते हैं।
चित्रा 5: एक नए ब्रैकट और एक समान एक है कि एक विस्तारित अवधि के लिए कठोर सतहों पर बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है और छोड़ दिया एक जेल बॉक्स में बीच तुलना करें। एक: शीर्ष; नया ब्रैकट के ऑप्टिकल छवि (प्रक्रिया देखें) है कि साफ किया गया है। तल; ऑप्टिकल छवि जेल बॉक्स से दिखाई संदूषण की उपस्थिति (नीले तीर) का प्रदर्शन है। बी: cantilevers 'संबंधित थर्मल स्पेक्ट्रा की तुलना।वर्ष ब्रैकट की पहली गूंज चोटी के विस्तार स्पष्ट है (हरा तीर) और कुछ उच्च आदेश मोड बढ़ा रहे हैं (नीले तीर)। स्पेक्ट्रा खड़ी ऑफसेट और स्पष्टता के लिए एक लॉग-लॉग पैमाने पर प्रस्तुत किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
आवश्यक उप नैनोमीटर संकल्प हासिल नहीं है, तो कम संकल्प पर स्वीकार्य छवियों के बावजूद, यह संभव है कि AFM टिप रासायनिक इसके भंडारण पर्यावरण के दौरान संशोधित हो गया है। यह 120 सेकंड है, जो टिप 60 पर हाइड्रोफिलिक सतह समूहों की रचना एड्स के लिए एक पराबैंगनी आक्सीकारक के लिए ब्रैकट चिप के जोखिम के द्वारा इलाज किया जा सकता है। जॉब हालांकि लिया जाना चाहिए, आवश्यक टिप ज्यामिति और यूवी शक्ति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं सही समय के रूप में, और अधिक जोखिम टिप और कम संकल्प के blunting में हो सकता है।
थर्मल शोर </ P>
उच्च संकल्प इमेजिंग बल में बदलाव और दूरी (आम तौर पर उप-पी.एन. बलों और उप Angstrom दूरी 78) को महान संवेदनशीलता की आवश्यकता है। नरम cantilevers के लिए, अपने आंतरिक ब्राउनियन गति (थर्मल कंपन) की वजह से ब्रैकट के थर्मो-यांत्रिक गति एक समस्या हो सकती है। पहली सन्निकटन में, कठोरता कश्मीर की एक ब्रैकट के साथ, यह संभव नहीं मापने के लिए की तुलना में छोटे सुविधाओं , थर्मल शोर, जहां कश्मीर बी बोल्ट्जमान स्थिर है और टी तापमान के आयाम। व्यावहारिक रूप से, उच्च गूंज आवृत्तियों के साथ ब्रैकट का उपयोग कर एक बड़ा आवृत्ति रेंज पर शोर फैलता है, और माप बैंडविड्थ 79 में समग्र शोर का स्तर कम कर देता है।
उच्चतर eigenmode इमेजिंग
यह कभी कभी अपनी दूसरी eigenmode पर ब्रैकट संचालित करने के लिए उपयोगी हो सकता हैवृद्धि प्रभावी कठोरता के कारण (प्रदूषण की चर्चा देखें)। व्यावहारिक रूप से, यह अपनी दूसरी eigenmode पर ब्रैकट ड्राइविंग द्वारा आसानी से किया जाता है (उच्च आवृत्ति पर दूसरे गूंज शिखर, चित्रा 1 ए देखें)। जब ब्रैकट ट्यूनिंग, बस मुख्य गूंज के बजाय दूसरी eigenmode का चयन करें और कदम के लिए 5.4 आगे बढ़ें। ध्यान दें कि InvOLS अलग है जब ब्रैकट दूसरी eigenmode पर संचालित है हो जाएगा; आमतौर पर ~ 1 / InvOLS एक आयताकार ब्रैकट के लिए कदम 5.2 में मापा के 3।
तकनीक का मुख्य सीमा है कि यह नमूना की सतह पर एक स्थिर solvation परिदृश्य की आवश्यकता है। नमूना काफी मजबूत नमूना खुद की महत्वपूर्ण विरूपण उत्प्रेरण बिना इंटरफेसियल तरल perturbing अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए। यह बहुत नरम और अस्थिर नमूने इतनी बड़ी biomolecules पर चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अतिरिक्त, छोटे आयाम AFM यहाँ वर्णित के रूप में पी के बारे में यांत्रिक जानकारी प्राप्त नहीं कर सकताएक नमूने के roperties, के रूप में ब्रैकट टिप इंटरफेसियल तरल पदार्थ में अपने समय के बहुमत खर्च करता है। इस के लिए, यह इस तरह के मात्रात्मक Nanomechanical मानचित्रण 80 के रूप में अन्य तरीकों का उपयोग करें या ब्रैकट गति की उच्च harmonics का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। उच्चतर हार्मोनिका आम तौर पर बढ़ा रहे हैं जब (कम गुणवत्ता कारकों के साथ) तरल पदार्थ में इमेजिंग 29,81 – 83 और एक साथ स्थलाकृति और नमूने 25,81 की कठोरता प्रदान कर सकते हैं – 84 लेकिन वे आम तौर पर उच्च संकल्प के लिए हानिकारक हैं। अन्य सभी स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए निहित सीमाओं अभी भी मान्य यहां विशेष रूप से तथ्य यह है कि अनिवार्य रूप से परिणामों को मापने टिप के बारे में जानकारी शामिल हैं। छोटे आयाम का उपयोग भी बड़ी ऊंचाई बदलाव के साथ नमूने के लिए आदर्श नहीं है; जब ऊंचाई रूपों इमेजिंग आयाम से बड़े होते हैं प्रतिक्रिया पाश अनिवार्य रूप से अधिक धीरे धीरे प्रतिक्रिया होगी, इसलिए नमूना और टिप नुकसान खतरे में डाल। उपयोग ओएफ नरम ब्रैकट एक निश्चित सीमा तक इस समस्या mitigates।
यहाँ प्रस्तुत विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रदान की मशीन के शोर का स्तर काफी कम कर रहे हैं कि तरल में उच्चतम छवि संकल्प AFM के साथ संभव प्रदान करता है, लेकिन किसी भी व्यावसायिक AFM पर लागू किया जा सकता है। वाणिज्यिक उपकरणों पर तुलनीय संकल्प आमतौर पर कड़ा cantilevers के साथ एफएम-AFM में संपर्क मोड में हासिल की है, या कभी कभी होता है। AM-मोड में है और अपेक्षाकृत नरम cantilevers के साथ कार्य करना नमूनों की एक व्यापक पसंद के लिए अनुमति देता है, और सबसे सिस्टम पर एफएम AFM से लागू करने के लिए आसान है। दृष्टिकोण संकल्प को बढ़ाने और स्थानीय रासायनिक जानकारी हासिल करने के लिए कोई ठोस और तरल के बीच इंटरफेस में मौजूदा solvation बलों शोषण पर निर्भर करता है। यह सिद्धांत रूप में परिवेश की स्थिति में इस्तेमाल किया जा सकता है, केवल पानी परतों (आम तौर पर कई नैनोमीटर मोटी) सबसे हवा की नमी के कारण सतहों पर निर्माण पर निर्भर है। सिद्धांतों अंतर्निहितउच्च संकल्प रणनीति अपरिवर्तित रहते हैं लेकिन टिप के अधिकांश, हवा में है टिप एपेक्स और नमूना 85 के बीच केवल एक केशिका पुल के साथ। उच्च संकल्प इन शर्तों 86,87 में कड़ी नमूनों पर प्रदर्शन किया गया है। इमेजिंग शर्तों ब्रैकट के दोलन की एक उच्च क्यू कारक के कारण हालांकि डूबे तरल के उन लोगों की तुलना में अलग हैं। व्यावहारिक रूप से, हम यह मुश्किल शायद केशिका पुल के अस्थायी परिवर्तन की वजह से मुलायम या अनियमित नमूने पर स्थिर आपरेशन प्राप्त पाया और एक दिया ब्रैकट कठोरता के लिए वृद्धि की क्यू कारकों।
प्रोटोकॉल यहाँ बताया सबसे आधुनिक वाणिज्यिक AM-सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा के साथ तरल में नमूनों की आणविक स्तर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए एक पद्धति प्रदान करता है। हम इमेजिंग मानकों की हमारी पसंद के पीछे वैज्ञानिक तर्क प्रदान करते हैं और solvation बलों की भूमिका पर जोर। हम भी आम समस्याओं और विशेष रूप से संदूषण में चर्चा की। विशिष्ट टिप नमूना बातचीत सीएn नाटकीय रूप से इमेजिंग समाधान, ब्रैकट ज्यामिति और सामग्री, और नमूना रसायन विज्ञान की सामग्री पर निर्भर करता है। स्कैनिंग के दौरान उपस्थित प्रमुख बलों की प्रकृति का एक व्यावहारिक समझ नई प्रणाली के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है और विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए इसलिए आवश्यक है। जब अनुकूलित किया है, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण समाधान में नमूनों की स्थानीय आणविक स्तर अंतर्दृष्टि में सीटू हासिल करने के लिए शक्तिशाली है।
The authors have nothing to disclose.
इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद से अनुदान (अनुदान 1452230 और ईपी / M023915 / 1), जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान बी बी / M024830 / 1) और यूरोपीय परिषद (FP7 CIG 631186) आभार स्वीकार कर रहे हैं।
Multimode IIIA AFM | Brucker | NA | One of the machine used |
Cypher ES AFM | Asylum Resarch | NA | One of the machine used |
AFM cantilever/tip | Nanoworld | Arrow UHF-AUD | best for high frequency |
AFM cantilever/tip | Olympus | RC800-PSA | versatile and cheap |
ultrapure water | Milipore | NA | lab filtering systems can induce contamination |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aaldrich | 200-664-3 | standard chemical, no further purification |
Monovalent salts | Sigma-Aaldrich | standard chemical, no further purification | |
Lipids | Avanti polar lipids | lipid bilayers formed using stadard protocols | |
Crystals | MTI | polished crystals | |
Scotch tape | 3M | Scotch Magic Tape | Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly |