Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים

המוח ידוע גיוון המאפיינים המבניים ותפקודיים של האלמנטים העצביים הפרט שלה. הבנת התפקידים של סוגי נוירונים ברורים בתפקודי המוח והפתולוגיה דורש אפיון זיהוי חד משמעי של הנוירונים. מבחינה מבנית, תכונות המורפולוגיות המוגדרות לפי מיקום somato-הדנדריטים לקבוע את תשומות פוטנציאל שתא מוח נתון מקבל, בעוד הדפוס של arborization אקסונלית מזהה מטרות postsynaptic פוטנציאליות. המגוון המבני של נוירונים כבר מוערך מאז ימי המחקרים היסטולוגית הזרע של רמון y קחאל ^1. הופעתו של טכניקות הקלטת תא בודד עולה כי נוירונים מבחינה מבנית גם להראות הבדלי דפוסי ירי ומאפיינים הסינפטי. המגוון במבנה ופיזיולוגיה בולט במיוחד נוירונים מעכבים GABAergic ^2,3. בנוסף, היא הפכה יותר ויותר נראה כי structurallנוירונים דומה y יכול להביע סמנים הנוירוכימיים שונים ולהראות מקביל הבדלים פונקציונליים ^4. בדומה לכך, נוירונים עם אותו הסמנים הנוירוכימיים יכולים להיות מבנים נפרדים ופונקציות ^5-10. לכן, בפועל, הניתוח של המאפיינים הפונקציונליים של נוירונים ותפקידם הרשת כרוך להגדיר הן זהויות מורפולוגיים הנוירוכימיים. אפילו עם כניסתו של קווי עכבר כתב מיקוד סמנים הנוירוכימיים ספציפיים, זה לעתים קרובות יש צורך לקבוע מורפולוגיה וזהות תת סוג מבוסס על immunohistology ^11.

השיטה הסטנדרטית המשמשת לאפיין תאים רשמו פרוסות מוח חריפות היא למלא אותם עם biocytin או Neurobiotin במהלך ההקלטה, לתקן את הסעיפים paraformaldehyde (PFA) בעקבות ההקלטות, ולהשתמש אימונוהיסטוכימיה כדי לחשוף את המורפולוגיה הנוירוכימיה. מאז עובי סעיפים עבור פיזיולוגיה פרוסה הם בדרך כלל 300 מיקרומטראו יותר, כי רוב הנוגדנים מצליחים לחדור לאורך כל הדרך בעומק זה, פרוסות צריך להיות מחדש מחולק ל -60 מיקרומטר או פחות כדי לאפשר immunostaining סימולטני biocytin וסמנים הנוירוכימיים ^12-14. למרבה הצער, resectioning מייגע; סיכוני אובדן רקמות במהלך חתך; ויכול להוביל דיפרנציאלי הצטמקות רקמות, שמסבך שחזורים מורפולוגיים. בנוסף, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול לעזור לצמצם את הסמנים המועמדים כי צפוי לבוא לידי ביטוי על ידי התאים. יש לנו שונה פרוטוקולי immunohistology biocytin הסטנדרטיים כדי לאפשר עיבוד סדרה של החלקים ראשונים להתאוששות של מורפולוגיה ואז לזיהוי סמנים הנוירוכימיים פוטנציאליים.

אימונוהיסטוכימיה היא חקרה חלוקת אנטיגן ברקמות או תאים וניתן מדמיינת באמצעות אנזים, תוויות ניאון, יסודות רדיואקטיביים, או חלקיקי קולואיד זהב ^15. אני ההליךnvolves באמצעות נוגדנים ראשוניים לתייג ולהגביר ספציפי אחד או יותר אנטיגנים במיוחד, ואחריו שימוש נוגדנים משני ניאון מיקוד הנוגדן הראשוני לשם ויזואליזציה. בשל הצורך להבחין בין ספקטרום הקרינה של כל נוגדנים משני ללא חפיפה, רק מספר מוגבל של אנטיגנים יכול להיבחן בו זמנית. לפיכך, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול להיות שימושי בבחירת סמנים הנוירוכימיים מועמד סיווג התא. מבחינה מושגית, את הרציונל מאחורי עיבוד סדר סעיפים כבר מוכתמים מבוסס על ההנחה כי immunolabeling עבור אחד חלבון או פפטיד אינו אמור להפריע antigenicity ו immunolabeling עוקבת עבור פפטיד עצמאית מבחינה מבנית ^16. חוסר ההתערבות זאת בשל הכריכה של נוגדנים על epitope חלבון מסוים על אנטיגן ולכן מאפשר מכתים סימולטני של אנטיגנים מרובים באותו הרקמות. מספר אנטיגנים revealeד על ידי immunostaining הוא מוגבל על ידי צורך ספקטרה שאינה חופפת של נוגדנים משני פלורסנט, בצורך למקד אנטיגנים בודדים עם נוגדנים וגדלו מינים שונים כדי לחסל ^17,18 תגובתיות צולבת. אמנם זהו ההיגיון מאחורי הסדרה ולא תיוג סימולטני עם שני נוגדנים ברורים שעשוי אינטראקציה, למיטב ידיעתנו, immunostaining עבור אנטיגן שני לא דווח לאחר השלים immunolabeling עבור אנטיגנים אחד או יותר על חלקים רכובים. כאן, אנו מתארים שיטה immunostaining סדר ויטראז'ים בעבר רכוב חלקים. בעוד אנו בפירוט את התהליך הזה עבור הליך immunolabeling סדר להחלמתם של מורפולוגיה ואחריו מכתים עבור סמנים חלבוניים / פפטיד חלקים עבים, אותם ההליכים ניתן להשתמש בתקן, סעיפים היסטולוגית דקים גם כן. בנוסף, אנו מתארים גישה מעשית למלא נוירונים מוקלטים עם biocytin והתהליך כדי לסלק אתאלקטרודה מהתא עם השלמת ההקלטות כדי לייעל את המילוי של axonal ו סוכות הדנדריטים של נוירונים, כמוצג ^6,8 העבודה האחרונה שלנו.

היתרון החשוב ביותר של ההליך המתואר כאן הוא כי המורפולוגיה של התא רשם ניתן לשחזר באופן מלא צלמה לפני שתנסה כריתה או immunostain הפרוסות. למרות בעיות עם החדירה של נוגדנים מסוימים עשויות להבהיר את זה צורך פרוס כריתה עבור immunostaining המשנית, הנהלים המפורטים כאן היו מונעים את הצורך לשחזר נוירונים מורכבים ממקטעים מרובים היה למנוע בעיות עקב אובדן רקמות הצטמקות הפרש, אשר יכולים לסכן את שיקום בעקבות resectioning. יתרון נוסף הוא כי התהליך יהיה להפחית עלויות, זמן, מאמץ, ונוגדנים יקרים ידי הגבלת immunostaining מחדש חתך פרוס שבו מלאה biocytin נוירונים הם התאוששו. ההיבט המעשי ביותר הוא המודעותimmunostaining ditional שניתן לבצע על חודשים מוכתם סעיפים לפני השימוש בטכניקה הנ"ל. בפרט, ההתאוששות של מורפולוגיה תפחית את הפוטנציאל ניכר כי נתונים פיסיולוגיים מתאי נמחקת בשל חוסר יכולת להשיג אפיון מורפולוגי בסיסי של סוג התא.