Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Das Gehirn ist in den strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen neuronalen Elemente der Vielfalt bekannt. die Rollen von verschiedenen neuronalen Typen in der Gehirnfunktion und Pathologie zu verstehen, müssen die Charakterisierung und die eindeutige Identifizierung von Neuronen. Strukturell die morphologischen Merkmale von somatisch-dendritischen Standort definiert bestimmen die möglichen Eingaben, die ein bestimmtes Neuron erhält, während das Muster der axonalen arborization Potential postsynaptischen Ziele identifiziert. Die strukturelle Vielfalt von Neuronen hat seit den Tagen von Ramón y Cajal brech histologische Untersuchungen ¹ geschätzt. Das Aufkommen von Einzelzellen-Aufnahmetechniken gezeigt, dass strukturell verschiedene Neuronen zeigen Unterschiede auch in Feuermuster und synaptische Eigenschaften. Die Vielfalt in der Struktur und Physiologie zeigt sich besonders deutlich in GABAergen inhibitorischen Neuronen ^2,3. Darüber hinaus ist es zunehmend deutlich geworden, daß structurally ähnliche Neuronen können verschiedene neurochemische Marker und zeigen entsprechende funktionelle Unterschiede ⁴ auszudrücken. In ähnlicher Weise Neuronen mit den gleichen neurochemische Marker können ^5-10 unterschiedliche Strukturen und Funktionen haben. So wird in der Praxis ergeben sich bei der Analyse der funktionellen Eigenschaften von Neuronen und ihre Rolle in dem Netzwerk definieren, sowohl die morphologischen und neurochemischen Identitäten. Sogar mit dem Aufkommen von Reportermauslinien spezifische neurochemische Marker Targeting, ist es oft notwendig , Morphologie und Subtyp Identität basierend auf Immunhistologie ¹¹ zu bestimmen.

Das Standardverfahren verwendet, um Zellen zu charakterisieren, in akuten Hirnschnitten aufgezeichnet ist, sie mit biocytin oder Neurobiotin während der Aufnahme zu füllen, fixieren Sie die Abschnitte in Paraformaldehyd (PFA) im Anschluss an den Aufnahmen und Immunhistochemie verwenden, um die Morphologie und Neurochemie zu offenbaren. Da die Dicke der Abschnitte für slice Physiologie sind typischerweise 300 umoder mehr, und weil die meisten Antikörper nicht den ganzen Weg durch diese Tiefe zu durchdringen, müssen die Scheiben 60 um oder weniger zu ermöglichen für die gleichzeitige Immunofärbung für Biocytin und neurochemischen Markern ^12-14 erneut geschnitten werden. Leider Resektion ist mühsam; Risiken Verlust von Gewebe während des Schneidens; und kann dazu führen, Gewebe Schrumpfung auf Differential, morphologische Rekonstruktionen zu komplizieren. Darüber hinaus könnte vorherige Kenntnis der Morphologie helfen, die Kandidatenmarker verengen, die wahrscheinlich von den Zellen exprimiert werden. Wir haben den Standard biocytin Immunhistologie Protokolle modifizierte serielle Verarbeitung von Abschnitten für die Gewinnung von Morphologie zuerst zu ermöglichen, und dann zur Identifizierung potenzieller neurochemischen Marker.

Immunhistochemie ist die Untersuchung der Antigenverteilung in Geweben oder Zellen , und kann mit einem Enzym, Fluoreszenzmarkierungen, radioaktive Elemente sichtbar gemacht werden, oder Goldkolloidpartikel ^15. Das Verfahren involves primären Antikörper unter Verwendung eines oder mehrerer spezifischer Antigene durch die Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper gefolgt spezifisch markieren und zu verstärken, den primären Antikörper für die Visualisierung Targeting. Aufgrund der Notwendigkeit, die Fluoreszenzspektren von jeder sekundären Antikörpers ohne Überlappung zu unterscheiden, nur eine begrenzte Anzahl von Antigenen können gleichzeitig geprüft werden. So könnte vorherige Kenntnis der Morphologie bei der Auswahl der Kandidaten neurochemischen Marker für die Zellklassifizierung nützlich sein. Konzeptionell ist das Grundprinzip hinter serielle Verarbeitung von bereits gefärbten Schnitten basiert auf der Prämisse , die für ein Protein oder Peptid – Immunmarkierung nicht mit Antigenität und anschließender Immunmarkierung für einen strukturell unabhängig Peptid ¹⁶ stören sollte. Dieses Fehlen von Störungen ist aufgrund der Bindung der Antikörper an ein bestimmtes Protein Epitop auf einem Antigen und daher ermöglicht die gleichzeitige Färbung von mehreren Antigenen im gleichen Gewebe. Die Anzahl von Antigenen revealed durch Immunfärbung wird durch die Notwendigkeit für die nicht überlappenden Spektren der fluoreszierenden Sekundärantikörper und durch die Notwendigkeit , zu zielen einzelnen Antigene mit Antikörpern , die in verschiedenen Spezies begrenzt , um Kreuzreaktivität zu eliminieren , ^17,18. Zwar ist dies die Argumentation hinter seriell anstatt gleichzeitige Markierung mit zwei verschiedenen Antikörpern, die unseres Wissens in Wechselwirkung treten kann, wurde eine Immunfärbung für ein zweites Antigen nicht nach der Beendigung der Immunmarkierung für ein oder mehrere Antigene auf montierten Abschnitten berichtet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur seriellen Immunfärbung von zuvor gefärbt und montiert Abschnitte. Während wir uns ausführlich diesen Prozess für eine serielle Immunmarkierung Verfahren zur Gewinnung von Morphologie gefolgt von Protein / Peptid-Markern in dicken Abschnitten Färbung können die gleichen Verfahren wie auch in Standard, dünne histologische Schnitte verwendet werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen praktischen Ansatz für aufgezeichnet Neuronen mit biocytin und den Prozess füllen das zu verdrängenElektrode aus der Zelle nach Abschluß der Aufnahmen die Füllung der axonalen und dendritischen Dorne von Neuronen zu optimieren, wie in unserem jüngsten Arbeiten ^6,8 dargestellt.

Der wichtigste Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweise besteht darin, daß die Morphologie der aufgezeichneten Zelle kann vollständig vor der Resektion oder immunostain den Scheiben Versuch gewonnen und abgebildet werden. Obwohl Probleme mit dem Eindringen bestimmter Antikörper machen kann es für die sekundäre Immunfärbung der Resektion Scheiben notwendig, die hier ausgeführten Verfahren würde die Notwendigkeit beseitigen, um komplexe Neuronen aus mehreren Abschnitten rekonstruieren und Probleme aufgrund von Gewebeverlust und unterschiedliche Schrumpfung vermeiden würde, die den Wiederaufbau gefährden können folgende Resektion. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die Verfahrenskosten zu reduzieren, Zeit, Mühe und teure Antikörper durch Immunfärbung begrenzen und Wieder sectioning zu Scheiben in denen Biocytin gefüllten Neuronen gewonnen werden. Die praktischste Aspekt ist die Anzeigesätzliche Immunfärbung, die die oben genannten Technik vor der Verwendung auf gefärbten Schnitten Monate durchgeführt werden kann. Insbesondere würde die Rückgewinnung von Morphologie erheblich reduzieren das Potential, daß die physiologischen Daten von den Zellen aufgrund einer Unfähigkeit verworfen ist eine grundlegende morphologische Charakterisierung des Zelltyps zu erhalten.