Анализ коронарных сосудов сердца в Сбрасывается эмбриональных сердец

Все исследования на животных было проведено в соответствии с ведомственным руководящим принципам по лицензии внутренних дел Великобритании. 1. Вскрытие и фиксирование эмбриональных сердец Эвтаназии задержанное беременной мыши на нужный день с помощью этически одобренного отбрасывания невидимых граней технику, например, CO 2 наркоза с последующим смещением шейных позвонков, и удалить эмбриональные мешочки 14, помещая их в 10 см чашке Петри заполнены фосфатным буферным раствором (PBS) , Использование рассекает микроскопом и пинцетом, осторожно откройте мешочки матки и удаление каждого эмбриона, перерезав пуповину и удаление желтка. Для целей генотипирования, удалите эмбриональных хвост и место в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для экстракции лизиса / ДНК позже. Для того, чтобы удалить сердце, гнездовым каждого эмбриона на его спине в PBS, заполненный силиконовым эластомером покрытием 35 мм чашки Петри, с использованием нержавеющей стали minutien штифтов. Использование тонких щипцов, CArefully открыть сундук и отделят большие сосуды, впереди сердца. Затем идущие позади сердца с пинцетом, возьмитесь сосуды позади сердца и потяните осторожно, чтобы удалить сердце; легкие могут уходить в то же время. Перенести сердце свежий 35 мм чашки Петри, содержащей PBS и использовать тонкий пинцет, чтобы обрезать ткань легкого, если это необходимо. Затем передать сердце в лунку 48-луночного планшета, заполненную холодным PBS. После сбора все сердца в 48-луночного планшета, аспирация PBS с остроконечного пластиковой пипетки Пастера и заменить 0,5 мл 4% параформальдегида (PFA). ВНИМАНИЕ: PFA является известным аллергенными, канцерогенными и токсичны. Fix E11.5 – 12.5 сердца в течение 15 мин, E13.5 сердца в течение 20 мин и E14.5 – 15.5 сердца в течение 30 мин в 4% PFA при комнатной температуре. Аспирируйте PFA с остроконечного пластиковой пипетки Пастера и полоскать сердца 2x в холодной PBS. ПредостережениеION: PFA является опасным и должны быть утилизированы в соответствии с институциональными нормами. Если сразу не используется для всей монтирования иммунное окрашивание (см раздел 2), обезвоживают сердца путем проведения последовательных 5 мин промывок в следующих растворах: 25% метанол / 75% PBS, 50% метанол / 50% PBS, 75% метанол / 25 % PBS. ВНИМАНИЕ: Метанол является токсичным, носить перчатки. Храните сердца при -20 ° С в 100% метанола. 2. Всего горе Иммунологическое эмбриональных сердец с анти-PECAM1 антитела Примечание: Анти-PECAM1 антитела работают хорошо для окрашивания коронарных сосудов (см шаг 2.4), но и любой пан-эндотелиальной маркер, который дает надежный сигнал будет лучшим выбором. При использовании сердца, которые были сохранены в 100% метаноле, передают в 1,5 мл микропробирок и регидратации путем проведения последовательных 5 мин промывок в следующих растворах: 75% метанол / 25% PBS, 50% метанол / 50% PBS и 25% метанол / 75% PBS. </li> Проницаемыми сердца путем проведения 3 х 10 мин промывок в 0,5 – 1,0 мл PBST (PBS / 0,1% твин-20), вращая при комнатной температуре. Блок сердца путем вращения в течение 1 ч при комнатной температуре в 1,0 мл 10% сыворотки козьего в PBST. Удалите блокирующий буфер с помощью остроконечного пластиковой пипетки Пастера или 1000 мкл кончика пипетки и заменить 400 – 500 мкл свежей блок, содержащий первичное антитело анти-PECAM1 разбавленный 1:50. Поворот пробирки в течение ночи при температуре 4 ° С. На следующий день, аспирация блок / первичное антитело с помощью остроконечного пластиковой пипетки Пастера или 1000 мкл кончика пипетки и проводить по крайней мере 6 раз 1 час промывок в 1,0 мл PBST, вращая пробирки при комнатной температуре. Заменить последний промывочный свежей блокирующем буфере, содержащем Флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, разбавленного 1: 500, и инкубировать в течение ночи при 4 ° С, при вращении. Защита от света, обернув пробирки в фольгу. На следующий день, аспирация блок / секричных антител с помощью остроконечного пластиковой пипетки Пастера и проводить по крайней мере 6 раз 1 час промывок в 1,0 мл PBST, вращая пробирки при комнатной температуре. Хранить сердца при температуре 4 ° С (защищенном от света месте), пока это необходимо. 3. Подготовка Очистка растворов и микроскопии Посуда Примечание: при визуализации сердца в Бэбб жизненно важно, чтобы ни один из раствора Бэбб не входит в контакт с компонентами микроскопа. Для этого следующий протокол содержит инструкции для приготовления силиконового эластомера запечатанных посуду, пригодные для флуоресцентной микроскопии, которые могут быть подготовлены заранее. Силиконового эластомера обеспечивает барьер, чтобы он содержал Бэбб и предотвратить его потенциально просачивается между стеклянным дном и поликарбонатных сторонах тарелки. Для получения силиконового эластомера покрытием блюда, принимают оптические стеклянным дном блюда культуры и поместите колпачок с 4 мл флакон с завинчивающейся крышкой (приблизительно 1,5 см в диаметре) В центре каждого блюда. Примечание: Это сформирует скважину для образца, когда эластомер наносят на блюдо. Наполните посуду с силиконового эластомера на глубину приблизительно 0,5 см, с помощью аппликатора картриджа, чтобы смешать два компонента, как они применяются, в соответствии с инструкциями производителя. Оставьте, чтобы вылечить в течение по крайней мере 24 часов, убедившись в том, что флакон крышкой остается в центре каждого блюда. Примечание: Используйте защитные очки, чтобы избежать случайного контакта силиконового эластомера с глазами. После отверждения эластомера, удалите флакон крышкой из каждой тарелки, то это оставит центральную скважину, где образец будет изображенную могут быть размещены в непосредственном контакте со стеклянным дном тарелки. Примечание: после отверждения эластомер должен быть твердым и сухим на ощупь. Приготовьте раствор Бабб (1 часть бензилового спирта на 2 части бензилбензоата). Это следует хранить в стеклянной бутылке и защищенном от света месте. ВНИМАНИЕ: BABB является токсичным, коррозионные раствор. Обращаться в вытяжном шкафу в то время как носить соответствующую защитную одежду. Смешайте Бэбб и метанол, чтобы сделать 50:50 раствор (1 – 5 мл) в стеклянный флакон. Защита от света, например, путем обертывания флакон в фольгу. 4. Обезвоживание, Клиринг и Монтажное червей для конфокальной микроскопией Примечание: Большие образцы могут быть очищены в 4 мл стеклянные флаконы, однако для небольших образцов (например, сердца до E13.5) лучше проводить процесс удаления непосредственно в микроскопии блюдо. Это помогает предотвратить "потерять" образцы как сердца становятся очень прозрачным, как только очищается. Для этих небольших образцов очистка происходит очень быстро, происходит в течение нескольких минут. Примечание: Защитите образцы от света во всех следующих шагов обертывания / покрытия труб и посуду фольгой. Перед очисткой, дегидратировани иммуноокрашиванию-сердца через ряд метанола путем вращения сердца при комнатной Температура в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в последовательных изменений из следующих растворов: 25% метанол / 75% PBS, 50% метанол / 50% PBS и 75% метанола / 25% PBS (5 мин в каждом). И, наконец, поворот на 3 х 5 мин в 100% метанола. Для сердца до E13.5, место в центре микроскопии блюдо; под микроскопом обеспечить сердце ориентируют его спинной стороной вверх. Удалите из метанола вокруг сердца с помощью остроконечного пластиковые пипетки Пастера. Используя чистую остроконечный пластиковую пипетку Пастера, добавьте Бабб: метанол 50:50 раствор в достаточном объеме, чтобы погрузить сердце (приблизительно 300 – 400 мкл). Как сердца иногда может перевернуться в растворе, проверьте ориентацию снова в то время как сердца все еще непрозрачны. Оставьте в растворе в течение 5 мин. Удалите 50:50 раствор в бутылке из стекла отходов в вытяжном шкафу и заменить Бабб, снова используя остроконечный пластиковые пипетки Пастера. Примечание: Большой объем не требуется; добавить Suffциент так, что сердце сидит в капле раствора. Сердце должно очистить в течение 5 мин. Для больших сердец, очистить образцы в стеклянных флаконах. Примечание: E15.5 сердце должно очистить в течение 30 мин-1 час, но может быть оставлена ​​на ночь при необходимости. После того как образец ясно, удалить раствор и заменить с минимальным объемом Бабб. Необязательно, крышка образца с покровным, чтобы помочь сохранить его на месте, однако это не является абсолютно необходимым. Используйте сердце для работы с изображениями. 5. Очищенные визуализации сердца конфокальной микроскопией Примечание: Изображения были захвачены на перевернутой конфокальной микроскопии с использованием 10X или 20X сухих целей. Несмотря на то, что можно использовать посуду на вертикальном конфокальной, особую осторожность следует соблюдать осторожность во избежание контакта с целью решения Бабб. Сбор Z-сканирование сердца 15. В зависимости от размера сердца, кафеля сканирования может потребоваться изображение , все сердце 16. <br/> ВНИМАНИЕ: Бабб является коррозионное раствор, носить чистые перчатки и убедитесь , что за пределами микроскопии блюдо свободна от Бабб. Соблюдайте осторожность при обращении блюдо и держать крышку на блюдо, чтобы свести к минимуму риск случайной утечки на микроскоп. Если цель рабочее расстояние позволяет, использовать большее увеличение для достижения фотографий регионов, представляющих интерес более высокого разрешения. 6. Анализ данных с помощью программного обеспечения Фиджи Откройте стек г изображений на Фиджи 17. Для того, чтобы аз проекцию всего стека или его части, нажмите на изображение и выберите стек, а затем Z проекта. Введите запуска и остановки номера ломтик, и выбрать тип проекции г, например, средней интенсивности, максимальной интенсивности. Для выделения отдельных судов в пределах стека срезов изображения используйте инструмент Blow (из меню плагинов выберите Сегментация, а затем Blow / Лассо) и нажмите на участках изображения для заполнения еач срез. С помощью команды Fill (нажмите на Edit, затем выберите Fill), чтобы заполнить выбранные области с цветом переднего плана выбора (нажмите на Edit, затем выберите Функции, а затем с помощью цвета переднего и заднего плана). Z проект изображение стека, как и раньше. 7. 3D Surface Volume Rendering коронарных артерий, генерируемой с использованием Imaris Нажмите на иконку превзойдет просмотра в верхней части экрана и перетащить файл изображения в окне данных. Нажмите на иконку View 3D в верхней части экрана. Выберите значок поверхности (синий значок), а затем нажмите на вкладку Create. Нажмите в диалоговом окне "Пропустить автоматическое создание, редактирование вручную" и нажмите на иконку Draw (тонкий значок карандаша). Выберите вкладку контур, а затем вкладку Режим. В режиме, нажмите на палочку волшебную или изолиний иконки. Выберите режим указателя при выборе указателя на правой стороне экрана, нажав рядом с "Выбрать", а затем нажмите на кнопку 'Draw9; коробка (в левом нижнем углу экрана). Используйте изолинии или волшебной палочки инструмент для выбора контуров артерий в последовательных срезах. Переход от среза нарезать с помощью ползунка Кусочек Position. Когда выбраны все контуры, нажмите на поле Создать поверхность. Окружающий объем можно сделать невидимыми, или сделать более или менее непрозрачным, используя режим наложения; нажмите на томе, чтобы выделить его, а затем выберите вкладку Параметры, а затем на вкладке Mode. Выберите Blend, и использовать ползунок, чтобы изменить непрозрачность. Захват изображений с помощью функции Snapshot.