Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Thilo D&#246;rfler; Tobias Eilert; Carlheinz R&#246;cker; Julia Nagy; Jens Michaelis

doi:10.3791/54782

JoVE Journal > Biochemistry

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Bioquímica

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

Published: February 09, 2017

doi:

10.3791/54782

Thilo Dörfler*¹, Tobias Eilert*¹, Carlheinz Röcker¹, Julia Nagy¹, Jens Michaelis¹

¹Institute of Biophysics,Ulm University

Summary

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.

Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Introduction

생체 분자의 구조를 결정하는 것은 그 기능을 이해하기위한 중요한 전제 조건이다. 구조 결정을위한 두 개의 잘 확립 된 방법은 극저온 전자 현미경 및 X 선 결정학 ^{^{^(1, 2)이다.}} 오늘, 두 가지 방법은 옹스트롬 수준 아래로 해상도를 가진 고해상도 구조 정보를 제공합니다. 이러한 두 가지 방법은 단백질 복합체 같은 큰 생 분자의 구조를 규명하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 기존의 방법은 지속적 지난 수십 년에 걸쳐 개선되어 왔지만, 큰 동적 과도 복합체 ^3을 조사하는 경우, 생물학적 구조의 복잡성은 여전히, 특히 구조 생물학에 중요한 도전을 제기.

고분자 복합체의 역학, 특히 구조 – 기능 관계를 연구하기 위해서, 단일 분자 방법론 잠을ided 유용한 정보 ^4. 여러 새로운 전략 구조 및 동적 정보를 획득하는 방법에 직교 제공 개발되었다. 예 고속 AFM ⁽⁵⁾ 기계적 조작 ⁶ 지역화 형광 현미경 ^(7)뿐만 아니라, 단일 분자 포스터 공명 에너지 전이 (smFRET) ^{^{^(8, 9)이다.}} FRET 매우 이른 이후에 의한 생체 거대 분자 ^(10)의 길이 규모의 거리에 의존하는 분자자를 지칭되었다.

smFRET의 한 특히 흥미로운 애플리케이션은 추론 smFRET 측정으로부터 얻어진 거리 정보를 사용하는 정보는 ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^15의 구조 </sup^> ^{^16,} ^{^17,} ^{^18,} ^{^19,} ^{^20,} ^{^21,} ^{^22,} ^23. smFRET 인해 높은 시간 분해능으로, 단백질 구조의 이동 부분의 위치는 국소 수있다. 그러나, 염료 분자에 대한 smFRET 데이터 중요한 보정 파라미터로부터 정량적 정보를 추출하기 위해 측정을 ²⁴ 동안 결정되어야한다. 이들 보정 계수로, FRET 효율 E _FRET은 공식을 사용하여 계산 될 수있다

,

어디 _A와 I _D </sUB는> 각각 공여체 및 수용체 분자의 형광 강도 (도 2 참조)이다. β-인자 수용체 채널에 크로스 – 토크에 대한 도너 발광 누설 계정에 의해 계산된다

나는 _'A와 _나'D 경우 기증자의 형광 강도와 수용체 분자의 사진 표백 후 수용체 분자이다.

γ 인자는 두 채널의 검출 상대 효율의 차이뿐만 아니라 도너의 형광 양자 수율 셉터 염료의 차이를 보정한다. 그것은으로 모든 개인 시간 추적 계산한다

이 설명은 종종 중요뿐만 아니라 보정 될 필요 셉터 분자의 직접적인 자극을 무시한다는 참고. 이러한 보정 인자를 결정하는 것은 광 신체적 변화 및 구조 역학 구별하기 위해 교류 방식 ^(25)에 도너뿐만 아니라 수용체 모두를 여기 시키는데 유용하다.

정량적 smFRET 효율뿐만 아니라 양적 구조 정보를 얻을뿐만 아니라 위해, 나노 포지셔닝 시스템 (NPS)는 2008 ^(26)에 도입 하였다. 이름은 위성 기반의 위성 위치 확인 시스템 (GPS)과의 유사성을 기준으로 선택되었다. 국민 연금은 biomacromolecular 단지에서 알 수없는 염료 위치의 현지화를 위해 smFRET 및 X 선 결정학 데이터를 결합하는 하이브리드 기술이다. 는 Crystal 구조는 기준 프레임으로서 작용하고 smFRET 결과를 알 수없는 위치 형광 (안테나)과 결정 구조 (위성)로부터 공지 된 위치 사이의 거리 정보를 획득하기 위해 사용된다. 연속적인 실험에서 안테나와 여러 개의 위성들 사이의 거리가 측정되고, 상기 안테나의 위치는 베이지안 파라미터 추정에 기초하여 통계적으로 엄격한 분석 기법에 의해 결정된다. 결과적으로, 상기 안테나의 위치를 가장 가능성뿐만 계산되지만 완전한 3D 불확실성 분포 소위 후방은 신뢰할 볼륨 시각화. 더욱이, NPS smFRET 완전한 네트워크 ^(27)의 분석을 허용하도록 확장되었다.

NPS는 진핵 전사 중요한 질문 상류 DNA, 비 – 주형 DNA 및 RNA 중합 효소 II 신장 공동 내의 초기의 mRNA 즉 과정들을 해결하기 위하여 사용되어왔다또한 전사 개시의 효과를 보여주는 mplex ^{^12,} ^28, ²⁶ 요인 ²⁹ 오픈 프로모터의 동적 구조는 복잡. 더욱이, NPS는 전사 연장 인자 Spt4 / 5 ^(31)와 동일한 위치에 경쟁적으로 결합하는 전사 개시 인자 TFE의 위치는 고세균 RNA 폴리머 라제 오픈 착체 ^(30)의 특히 구조를 규명 하였다.

이후 smFRET 기반 구조 방식의 수는 ^{^15,} ^{^18,} ^{^21,} ^23을 발표 하였다. 다른 smFRET 기반 구조 방법을 비교하면,이 방법의 정밀도 명백한 색소 모델의 특정 선택에 크게 의존하는 것이 분명해진다. 하나는주의해야염료 분자는 지역 환경에 따라 서로 다른 공간과 배 양성 문제가 발생할 수 있습니다.

이를 위해, 빠른 NPS는 ³² 도입되었다. 고속 NPS 크게 계산 시간을 감소시키는 향상된 샘플링 알고리즘을 사용한다. 또한, 고속 NPS는 하나의 구조 분석을 수행하고 각 염료 분자의 사용자는 다음에 설명한다 다섯 가지 염료 모델 세트를 선택할 수 있습니다. 고전 불리는 가장 보수적 모델 염료는 하나이지만 알려지지 않은 위치를 차지하는 것으로 가정한다. 이 위치에서, 형광 물질은 크기가 각각의 (시간에 따른) 형광 이방성 결정하는 콘에서 자유롭게 회전 할 수있다. 원뿔의 방향으로 측정 된 거리 smFRET 효율 변환시 큰 불확실성에 이르게하는 공지되지 않는다. 그것은 다른 염료 모드에 비해 작은 정밀도로 이끌 것이기 때문에 이러한 점에서, 모델은, 보수적LS. 매우 짧은 거리를해야 띄게 잘못된 위치 결정에 클래식 모델 리드에 의해 가정. 전형적인 smFRET 값의 경우, 정확한 위치는 항상 비교적 큰 신뢰할 수있는 볼륨에 묶여 있습니다.

보다 정밀 바람직하므로 그러나, 개발 및 정밀도를 향상시키기 위해 도움이 될 다른 염료 모델을 시험하는 것이 중요하다. 염료 고유의 형광 수명보다 빠르게 회전하면, 소위 ISO 모델을 적용 할 수있다. 여기서, ² κ 배향 계수 (특성 등방성 포스터 반경을 계산하기 위해 필요한 ) 2/3로 설정됩니다. 전형적인 모델 ^{(32)에서와} 비교하여 그 결과 계산 신뢰할 볼륨은 작은 크기의 약 2 명령이다. 빠른 reori뿐만 있도록 형광이있는 환경에서 발견되는 경우에모든 액세스 볼륨 이상이 정해져있는,하지만 또한 빠른 동작은 meanpos 이소 모델이 사용되어야한다. 이 모델에서, 상기 염료는 효과적으로 공간적 평균화 다항식 거리 변환 ^(15)에 의해 차지되는 평균 하나의 위치를 차지한다. 예를 들어, (일반적으로 소수성) 염료는 친수성 영역, 예를 들면, DNA에 연결되어있는 경우,이 모델이 적용됩니다. meanpos 이소 모델의 적용은 약 2의 팩터에 의해 신뢰할 볼륨의 크기를 더욱 감소 리드. 그러나, 단백질에 결합 염료는 입체적 액세스 볼륨 (AV)의 몇몇 소수성 패치에 가역적으로 결합 할 수 있습니다. 순간적으로이 지역 사이에서 전환하지만, 한 지역이 자유 회전을 겪게하고 내 빠른 현지화 움직임이 가장 VAR-meanpos 이소 모델에 의해 설명되는 형광. 비슷한 상황에있는 염료는 모델이 적용되는 VAR-meanpos을 자유롭게 회전 할 수 없습니다. 더 라 이 모델에 대한 etails는 우리의 최근 출판물 ^(32)에서 찾을 수 있습니다.

이 모델은 특히 염료 발생할 수있는 다양한 환경을 설명하고이를 적용하는 것은 현명 현지화 정밀도를 최적화에 광범위한 레퍼토리를 제공합니다. 고속 NPS의 특정 위치에 부착 된 각 염료 분자는 FRET-파트너가 서로 다른 모델이 허용되도록, 각각의 모델에 할당 될 수있다. 이 무한한 및 확대에 자연을 모델링 할 수 있습니다. 그러나, 하나의 최종 모델의 조합에 의해 얻어진 결과는 실험 데이터와 일치 여전히되도록 엄격한 통계 학적 테스트를 수행하는 것이 중요하다. 이 시험은 빨리 NPS 소프트웨어에 포함되어 있습니다.

실험 데이터에 고속 NPS를 적용하기 위해 (단지) 세 개의 입력 변수의 측정이 필요하다. 우선, 색소 쌍 특정 등방성 포스터 반경 (/54782/54782eq5.jpg "/>)를 정의 할 필요가 도너 염료. 따라서, 양자 수율 (QY) 상기 도너 형광 발광 스펙트럼과 수용자의 흡수 스펙트럼을 측정 할 필요가있다. 이러한 측정은 수행 될 수있다 표준 분광기 및 표준 형광 분광기를 사용하여 대량. 각각의 쌍의 경우, R _0은 프리웨어 PhotochemCAD을 사용하여 계산되고, NPS 분석에 사용될 수있다. 또한, 염료 분자 (시간 – 분해) 형광 이방성 필요 편광 (시간)에 민감한 형광 분광기를 사용하여 얻을 수있다. 그러나, 고속 NPS 가장 중요한 입력 파라미터는 전반사 형광 현미경 (TIRFM)와 같은 단일 분자 형광 현미경 설정에서 측정 smFRET 효율이다 .

여기서는 smFRET 데이터를 획득하고 고속 NPS (도 1)를 적용하는 단계별 프로토콜을 제시한다.

Protocol

1. 전제 조건 및 실험실 장비 참고 : 측정 챔버의 어셈블리는 그림 3에 도시되어있다. 석영 유리 (용융 실리카) 슬라이드 실링 필름 및 유동 챔버를 밀봉하는 커버 슬립 : 측정 챔버의 샌드위치 디자인은 세 가지 주요 구성 요소를 포함한다. 측정 챔버 맞춤 샘플 홀더 상에 장착된다. 샘플 챔버 및 금속 홀더의 크기는 표준 현미경 석영 유리 슬라이드 (76mm X 26mm)에 맞게 준비되어 있습니다. 컷 수정도 4에 나타낸 위치에서의 다이아몬드 드릴 (0.75 mm)를 사용하여 유리 슬라이드. 석영 유리 슬라이드의 디자인은 각 슬라이드의 양측 사이를 구별하기 위해 비대칭이다. 주 : 표면이 긁힌 될 때까지 석영 슬라이드가 측정 후 다시 사용할 수 있습니다. 그림 5 <에 도시 된 바와 같이 챔버를 탑재, 사용자 정의 금속 샘플 홀더를 사용하여/ strong>을. 샘플 홀더 입구 및 유동 챔버를위한 출구 배관을 연결하기 위해 두 개의 스레드 (M4)를 포함한다. 또한, 상기 금속 홀더의 하부 절반에 프리즘 홀더를 고정하는 금속 홀더뿐만 아니라 스레드 (M3) 상에 샘플 챔버를 장착 나사 (M3)을 사용한다. 프리즘 형 전반사 형광 현미경 (TIRFM) (그림 6)에서 smFRET 측정을 수행합니다. 참고 : 기증자의 여기 및 수용체 염료 분자뿐만 아니라 블루 레이저 (491 nm의과 적색 레이저 (643 nm의 다이오드 레이저) : 녹색 (YAG 레이저 532 nm의, 노스 다코타 :)에 TIRFM 세 가지 레이저를 갖추고 있습니다 smFRET 측정 전에 샘플 챔버 백그라운드 형광 불순물 표백 다이오드 펌핑 고체 레이저). 세 개의 레이저 빔을 공간적으로 조합 및 음향 광학 가변 필터 (AOTF)을 통해 선택 될 수있다. 형광 빛이 높은 조리개 목적에 의해 수집, 기증자로 분할하고 동의두 EM-CCD 카메라 상에 다이크로 익 미러 투사를 이용하여 채널. 샘플 챔버는 두 개의 스텝퍼 모터를 X 및 Y 방향의 이동을 가능하게하는 마이크로 스테이지에 부착된다. 세번째 압전 모터는 전체 실험에서 최적 초점을 보장하기 위해 자동 초점 시스템을 구축 할 수있는 IR 레이저 및 위치 감지 검출기와 함께 사용된다. 프렛 시간 궤도에 역학 (25)을 관찰 번갈아 레이저 여기 (ALEX)를 사용합니다. 이러한 역학은 분자 내에서 하나 구조적 변화에 의해 또는 수용체 밝기와 수용체 깜박임의 변동에 의해 발생할 수 있습니다. 참고 : ALEX이 두 가지 원인 사이의 차별을 허용하고 역동적 인 FRET 궤도의 오해를 방지 할 수 있습니다. 그러나, 간략화 이유로 프로토콜 부분 ALEX없이 촬영 한 동영상 및 분석에 제한된다. 주의 : 클래스 3B 레이저가 단일 분자 형광 설치에 사용됩니다. 그 적절한 라 확인시스템을 사용하기 전에 버리는 안전주의 사항은, 지방 정부의 규정에 따라, 촬영되었다. (재료 및 방법 참조) UV-VIS 분광기의 양자 수율을 결정하기 위해 사용되는 흡수 측정을 수행한다. (재료 및 방법 참조) 상기 도너 형광 방출 스펙트럼 셉터 흡수 스펙트럼 및 형광 분광기상에서 형광 이방성의 측정을 수행한다. 출판 절차 (33)에 따라 샘플 챔버를 준비합니다. 대안 적으로, 절차는 [34]에서 사용될 수있다 기재. smFRET 적합 도너 – 억 셉터 염료 분자 쌍으로 조사 샘플 레이블 및 샘플 챔버의 표면에 고정화 비오틴 부위가 있는지 확인합니다. 주의 : 다른 샘플 구조가 필요한 고속 NPS 소프트웨어 미지 안테나 염료 위치 지역화하기 위해. 모든 구조의 Needs 미지 안테나 염료 위치에서 하나의 라벨과 결정 구조에서 공지 된 위성 위치에서 하나의 라벨을 갖고있다. 안테나 위치에 부착 된 염료 및 세 개의 다른 위성 위치와 함께 3 개 이상의 구조는 정확한 결과를 위해 요구된다. 안테나 사이뿐만 아니라 위성 사이의 측정은 또한 정확도를 개선하는데 유용하다, 그러나, 이것은 정확하게 분석에 입력해야하는 염료 분자의 교환을 필요로한다. 사용자 정의 홀더의 흐름 챔버 2. 장착 중공 탭 나사 (M4)에 실리콘 튜브 (0.8 mm의 ID, 2.4 mm의 OD)를 당겨 모두 직선 날카로운 면도날을 사용하여 양쪽에 1cm의 오버행을 떠나 끝에 튜브를 잘라. 탭 나사의 일측에 약 2 mm의 튜브의 돌출을 조정한다. 석영 유리 슬라이드의 구멍은 샘플 홀더의 나사산과 일치하는 방식으로 샘플 홀더에 유동 챔버를 탑재. 죄다입구 및 출구 나사 부드럽게 샘플 챔버의 입구 및 출구가 여전히 꿰뚫어되도록. 조심스럽게 유량 용기의 위치를 해결하기 위해 아크릴 유리 홀더의 네 개의 나사를 조입니다. 컷 실리콘 튜브 20cm 긴 조각으로 (0.58 mm의 ID, 0.96 mm 외경). 입구 및 측정 챔버의 출구 나사에 조각 중 하나를 삽입합니다. 클램프를 이용하여 입구와 출구 튜브를 닫습니다. 주 : 조립 샘플 챔버는 최대 2 주 동안 실온에서 저장 될 수있다. TIRF 현미경 3. smFRET 측정 PBS 500 μL로 샘플 챔버를 씻어 주사기를 사용합니다. 다른 완충액을 변경하기 전에 흡입 호스의 끝에 방울을 생성함으로써 항상 샘플 챔버에 들어가는 기포를 방지한다. 100 μL의 비딘 (0.5 밀리그램 / PBS에서 ml) 용액과 샘플 챔버를 세척하고, 실온에서 15 분 배양한다. 빨래PBS 500 μL와 뉴트라 비딘 솔루션 아웃. 샘플 챔버 상에 프리즘 금속 홀더 스크류. TIRF 현미경의 마이크로 미터 단계로 샘플 챔버를 탑재합니다. 프로세스를 스캔하는 동안 디 포커싱 방지하기 위해 목적의 앞에 수평으로 직선 가능한 샘플 챔버를 장착해야합니다. 전각 CCD 카메라와 스테이지의 압전 모터를 제어하기위한 소프트웨어를 제어하는 소프트웨어를 시작한다. 적외선 레이저의 반사를보고 현미경 대물 렌즈의 초점을 조정합니다. 금속 프리즘 홀더 위에 프리즘 (PS991, N = 1.52)를 배치합니다. 레이저 빔이 프리즘 후 접착제를 사용하여 5 분 동안 UV 광으로 부화 충돌이 있는지 확인하기 위해 프리즘의 횡 방향 위치를 조정한다. 주 : 장착 프리즘 청소하여 재사용 할 수 있습니다. 카메라 제어 소프트웨어를 클릭 "설정 취득"에서 다음과 같은 인수 매개 변수 정의 : 100 밀리 integrat을이온 시간은 401 프레임 / 동영상 (녹색 카메라), 400 프레임 / 동영상 (빨간색 카메라), 전자 승수는 14 비트에서 225, 프리 앰프 게인 5 배 및 판독 속도 3 메가 헤르츠를 얻을 수 있습니다. 측정을위한 로컬 하드 드라이브에 폴더를 만듭니다. 년 – 월 – 일, 예를 들어, 측정 파일에 원하는 이름을 선택합니다. 설정은 "자동 저장"라이더로 이동 소프트웨어에서 "자동 저장"활성화 * 영화 인수 된 .sif을 파일 형식을 선택합니다. 하드 디스크의 폴더를 선택합니다. filestem으로 폴더 이름을 사용합니다. 은 "AutoIncrement는"기능 (1 세트 시작 값)을 사용합니다. 파일 이름에 운영자의 첨부 파일을 사용합니다. 각각 기증자 및 수용체 채널에 대해 "DON"와 "ACC"를 사용합니다. 구분자로 "_"를 선택합니다. "비디오"의 카메라 제어 소프트웨어의 클릭으로 co.kr에서 세 가지 레이저의 최대 레이저 강도를 (사용하여 샘플 챔버를 스캔하여 카메라와 표백제 배경 형광의 라이브 영상을 시작합니다bined ≈3,000 W / cm 시야 당 2 10 s) 등이 있습니다. 청색 레이저를 끄십시오. 레이저 여기 (ALEX)를 교류하는 것은 사용되는 경우 적색 레이저를 위해 약 200 W / cm 2, 40 mW의 / cm 2의 녹색 레이저의 강도를 낮 춥니 다. 50-100 (PM)의 농도로 비오틴 형광 샘플을 희석한다. 용액의로드 100 μL. 샘플은 결합시 챔버 표면에 고정된다. 참고 : 챔버에 과부하가되지 않도록해야합니다. 이웃하는 분자들은 서로 분리되어야한다. 필요한 경우, 챔버에 2 배 더 농축 된 시료의 추가 100 μL를로드합니다. 로딩이 완료된 후, 클램프를 사용하여 상기 측정 챔버의 입구 및 출구 관을 밀봉. 모든 레이저를 끄고 더 유량 용기를보기의 두 필드를 이동 압전 모터를 사용합니다. 카메라 제어 소프트웨어에서 동영상 촬영 및 스위치를 시작하기 위해 "가라 신호"를 클릭동시에 레이저에. 분자의 80 % 이상이 레이저 파워 조정에 의해 영화의 최종 표백되었는지 확인. 반복 전체 prebleached 샘플 챔버 지역의 3.17 및 3.18 단계를 반복합니다. '변환지도 4. 취득 ( "beadmap") 섹션 1.1, 1.2 및 2에 기술 된 바와 같이 유동 챔버를 준비한다. 기증자의 형광 방출 및 수용체 채널을 보여 아비딘 – 코팅 된 형광 멀티 스펙트럼 구슬을 사용합니다. 1 분에 대한 재고가, 다음 1 분 동안 다시 50 μL DDH 2 O. 소용돌이에 주식의 50 μL를 희석 소용돌이는, 1 ~ 2 분 후 또 다른 10 초 와동 초음파 처리. smFRET 측정 (제 3.5-3.10)에 기술 된 단계를 수행합니다. 유량 용기에 2 희석 형광 구슬 : 1의로드 100 μL (1 챔버 체적). 형광 구슬 표면에 결합하는 10 분을 기다립니다. 3.9 그러나 찬에 인수 매개 변수를 사용하여GE의 영화 (26)에 길이 (녹색 카메라), 25 (빨간색 카메라) 및 (10)에 전자 증 이득. 20 W / cm 2의 값으로 그린 레이저의 강도를 설정한다. 약 50 ~ 100 구슬 시야에 하나의 영화를보세요. 5. 처리 및 분석 smFRET 데이터의 및 취득 영화 (재료 및 방법 참조) beadmap의 분석을 위해 사용자 정의 작성된 소프트웨어 SM의 FRET를 사용합니다. 프로그램 viewPlot1.m을 시작합니다. 가 사용되지 않은 경우 옵션 "알렉스"를 선택 취소, 배치 분석 | 분석을 클릭합니다. 최적의 성능을 위해 "높은"피크 발견에 대한 임계 값을 선택합니다. 보도는 "OK". beadmap가 이미 분석 된 경우 물었을 때 "NO"를 선택합니다. 획득 beadmap이 들어있는 폴더를 찾아 (더블 클릭에 의해) * 된 .sif 파일을 선택합니다. 다음 대화 창 언론 "OK". 참고 : beadmap은 이미 이전의 측정에서 분석 한 경우, 표준, 여기에 "예"를 선택하고 beadmap * .MAP 파일을 올바른 폴더를 두 번 클릭으로 검색하여 저장 beadmap을 선택합니다. 단계 5.8를 계속합니다. 시야의 반대 모서리에 위치한 두 개의 작은 구슬을 선택합니다. 픽셀 강도는 색으로 구분 다크 블루 (저 강도)에서 진한 빨간색 (고강도)에 있습니다. 첫 번째 비드의 중심을 클릭합니다. 분자의 중심이 색상 코딩에 의해 명확하게 위치 할 수있는 경우, "YES"를 선택 그렇지 않으면 "NO"를 클릭하고 다른 분자 쌍을 선택합니다. "유지"최대 강도를 눌러를 나타내는 픽셀에 십자선을 배치합니다. 제 2 채널과 과정을 반복합니다. 반대 모서리에있는 분자를 클릭하고 반복 5.5 및 5.6 단계를 반복합니다. 참고 : 두 채널의 상대적인 픽셀 시프트 명령 창에 표시되고, 변환 맵이 자동으로 .sif 파일 beadmap *이 들어있는 폴더에 * .MAP 파일로 저장됩니다 <./ 리> 은 "배치 분석"에 대한 기증자 및 수용체 영화 (* 된 .sif)을로드하려면 분석한다 모든 영화를 선택하고 폴더로 이동하고 "확인"을 클릭합니다. 다음 대화 창에서, 누르십시오 "OK". 주 : 명령 창에 표시된 마지막 레인이 시작되면 배치 분석이 완료되면 "완료 분석 …". 검출 된 분자는 기증자의 상대적 이동과 변환 맵에서 결정된 수용체 채널을 나타내는 새로운 창에 표시됩니다. 로드 | 일괄 동영상 파일이 파일을 클릭로드합니다. 이 옵션이 사용되지 않은 경우 "알렉스"를 해제합니다. (10)에 smoothwidth을 설정하고 "OK"를 클릭합니다. * .ttr 파일이 들어있는 폴더를 선택하고 다음 컨텍스트 메뉴에서 "OK" "모두 선택"을 클릭합니다. 표시된 추적 토글 버튼의 특성 smFRET 단계 (그림 2)을 눌러 기능을 경우 "선택하지 않음"먼저마우스 커서가있는 라인을 이동시키고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 FRET 이벤트의 시작 시점을 선택한다. 다음 셉터 분자의 표백 및 도너 분자의 백화의 마지막 시점의 시점을 선택한다. 다음 창에서 FRET 효율은 파란색으로 그려집니다. 추적 보도를 선택하려면 "예"버튼을, 그렇지 않으면 "아니오"를 선택합니다. 한 번 추적은 "이전"버튼을 클릭 다시 액세스 할 수 있습니다. 영화의 마지막 분자 때까지 절차를 반복합니다. "| 저장 파일"영화의 마지막 분자를 분석 한 후 클릭하여 선택 흔적을 저장합니다. * 표시 된 .sif 파일과 같은 폴더에 선택한 흔적을 저장합니다. 반복 모든 인수 영화 5.10-5.13 단계를 반복합니다. 프로그램 combine_fret_results.m을 실행합니다. * .RES 파일과 모든 * .FRETonly_trace 파일이 들어있는 폴더를 선택합니다. MW.dat와 분자 현명한 FRET 및 프레임 현명한 FRET 파일을 저장하고각각 FRW.dat. 주 : * .dat 파일이 ASCII 파일로 저장됩니다. FRW.dat 파일은 여섯 열 및 각 FRET 프레임에 대한 하나의 행이 포함되어 있습니다. 여섯 번째 열은 수정 된 프레임 현명한 FRET 효율이 포함되어 있습니다. MW.dat 파일은 21 열 및 선택 FRET 분자 당 하나의 행이 포함되어 있습니다. 세 번째 열은 분자 현명한 FRET 효율이 포함되어 있습니다. 6. 히스토그램에서 smFRET 데이터 표시 주 : 모든 기록 smFRET 데이터 프레임이 많다는 데이터 또는 분자 현명한 데이터를 막대 그래프에 플롯과 가우스는 (복수) 피크에 맞는 사용하여 분석의 평균 smFRET 효율을 추출하기 위해. 이하,이 프로토콜 (자재 목록 참조) 상용 데이터 분석 소프트웨어를 사용한다. 그러나, 임의의 다른 가능한 소프트웨어가 대신 사용될 수있다. 데이터 분석 소프트웨어를 엽니 다 (자료 목록 참조). 가져 오기 | | 여러 ASCII 파일을 클릭합니다. FRW.dat 파일이 들어있는 폴더를 선택합니다. 파일을 선택하고 Enter를 누릅니다 "OK & #34 ;. 변화없이 "OK"를 입력 옵션을 적용합니다. 통계 | | 히스토그램 수정 FRET 효율을 포함하는 세 번째 열 C (Y)를 선택, 열을 선택 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 히스토그램 창에서 열을 두 번 클릭하고 "자동 비닝 (binning)"을 선택 취소하고 원하는 빈 크기, 예를 들어, 0.05를 선택합니다. 또한, 예를 들어, -0.025과 1.025을 시작과 끝 값을 선택합니다. 그들에 왼쪽 버튼으로 클릭하여 히스토그램의 열을 선택합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "빈 워크 시트로 이동"을 선택합니다. 그것에 왼쪽 클릭하여 "카운트"열을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 플롯 | 칼럼 / 바 / 파이 | 열입니다. 피팅 | | 비선형 곡선 맞춤 | 열기 대화 상자 열 막대 그래프에서 분석로 이동합니다. 기능에서 "가우스"을 선택 후 "파라미터"라이더로 이동합니다. 자동 파라미터 초기화를 취소합니다. "맞춤"에 0 클릭의 오프셋 값 (Y0)을 수정합니다. 주 : 맞는 기능뿐 아니라 피팅 드꼬리는 이제 열 그래프에 표시됩니다. 은 "XC"값은 적합 함수, 즉 NPS 소프트웨어에 대한 입력 매개 변수로서 역할 평균 FRET 효율성의 중심을 준다. 양자 수율 7. 측정 WURTH 등의 알 의해 기술 된 절차와 비슷 상대적인 방법으로 양자 수율 결정을 수행합니다. (35), 표준 에탄올 (QY = 91.5 %)에 용해하여 101 로다. 1cm 경로 길이의 흡수 큐벳에 80 μL 부피를 이용한 UV-VIS 분광계에서 기록 흡수 스펙트럼. 형광 여기에 사용되는 파장에서의 흡광도는 0.05 ≤되어야한다. 광자 카운트 모드로 동작 램프 보정 분광기상에서 기록 발광 스펙트럼. spectr를 사용하여 여기 (0 °) 및 배출 (54.7 °) 경로 (마법의 각도 조건)에 글란 – 톰슨 편광자와 측정을 수행 각각 약 5 nm의 여기 및 발광 분광기 2.5 나노 미터의 대역폭을 알. 측정 샘플 카운트 속도가 106의 -1 초과하지 않는 3mm 경로 길이 복용주의 형광 큐벳로 전송 후. 에 따라 양자 수율을 계산 N 및 N은 각각 표준 시료와 표준의 용매의 굴절률 어디. F (λ) 및 f_Std (λ)는 샘플의 형광 강도 및 파장 λ에서 표준이다. A (λ 예) 및 표준 (λ의 예) 여기 파장에서 시료와 기준의 흡광도하고 Φ의 표준은 표준의 양자 수율입니다. 제작 "> 8. 등방성 포스터 반경의 계산 (등방성의 포스터 반경을 계산 ) 도너 분자의 발광 스펙트럼과, 억 셉터 분자의 흡수 스펙트럼, 도너의 양자 수율과 매질의 굴절율. 의 계산 프리웨어 PhotochemCAD을 사용 . 그러나 다른 사용할 수있는 소프트웨어 대신 36 사용할 수 있습니다. 이방성 9. 측정 다양한 여기 / 방출 편광판 설정 (V / V, V / H, H / V, H / H) (36)와 형광 스펙트럼의 녹음에서 정상 상태 형광 이방성을 결정합니다. 로부터 각 파장에 대해, 악기의 편광 유물에 대한 수정 G-계수를 계산비율 각 파장에 대한 이방성 값을 계산하는 데 사용 어디 XY로하는 것은 여기 편광 x와 배출 편광 Y의 강도를 나타냅니다. 정상 형광 이방성을 계산하기 위해, 발광 스펙트럼 범위에서 값을 평균. 빠른 NPS 소프트웨어의 10 설치 http://www.cgl.ucsf.edu/chimera에서 UCSF 키메라를 다운로드 및 설치 가이드를 따릅니다. 은 "생물 물리학 연구소"의 웹 사이트로 이동https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html : 울름 대학. 빠른 NPS의 현재 버전을 다운로드하여 원하는 폴더에 압축을 풉니 다. "재배포 가능"하위 폴더를 열고 시스템에 적합한 비주얼 C ++ 재배포를 설치합니다. 11. PDB 파일을 중심으로 키메라에 대한 관심의 PDB 파일을 엽니 다. 중심의 좌표를 거대 분자 복합체의 모든 원자를 선택하고 계산 (도구 | 구조 분석 | 축 / 비행기 / 무게 중심 | 정의 중심 … | 확인). 및 변환 도구 (도구 | 운동 | 좌표 변환) | 회신 로그인 (로그인 답글 즐겨 찾기)를 엽니 다. 좌표를 변환 윈도우의 텍스트 상자에 "시프트"로 대답 로그인 도시 중심의 좌표를 입력하고 각 좌표의 부호를 변경합니다. 보도는 "적용"및 "저장 PDB"(파일 | 저장 PDB)에 파일을 저장합니다. 12. 설정[위치] 사도 최대 참고 : 모든 값은 옹스트롬으로 간주됩니다. 기술 컴퓨팅 언어를 시작하고 로컬 패스트 NPS 폴더로 현재 폴더를 변경합니다. 명령 창에 입력 FastNPS합니다. 프로젝트 관리자 (| 새 프로젝트)에 새로운 jobfile을 만듭니다. (| 이전 모델 염료 도구) 위치 이전을 설정합니다. 패널 "이전의 기본"에서 그 값을 입력하여 이전 위치의 공간 해상도를 정의 (2 권장). 체크 박스를 활성화하고 "부하 PDB"버튼을 클릭하여 고분자의 내부를 제외합니다. 선택과 11 절에 설명 된대로 중심 PDB 파일을로드합니다. 값을 입력하여 염료 (설명을 참조, 13 Å 권장) 대략 지름을 지정합니다. 즉 skeletonization 거리, 염료 분자는 고분자에 침투 수있는 거리를 입력합니다 (2 Å 권장). 에서패널 "최대 이전에 크기가"위치 이전의 최소 및 최대 좌표 입력 (권장 :에서 [-150,150]에서 Y 및 Z [-150,150]에있는 X를 [-150,150]). 위성을 정의 할 때, 패널 "이전의 기본"의 체크 박스 "유연한 링커를 통해 첨부 파일"을 활성화하고 염료 분자가 부착되는 패널 "링커"합니다 (중심 PDB 파일) 원자의 좌표를 입력합니다. 또한, (설명을 참조, 13 Å 4.5 Å 권장합니다) 그 값을 입력하여 길이와 링커의 직경을 지정합니다. 안테나의 경우이 점을 건너 뜁니다. "액세스 볼륨을 계산"버튼을 누릅니다. 이전 위치를 저장하고 선택적으로 키메라와 같은 소프트웨어를 사용하여 시각화 목적을 보냅니다. 13. 네트워크 형상을 정의 (가) 측정 창 (| 편집 지오메트리 모드) 정의를 엽니 다. 엉덩이를 눌러 새로운 염료 분자를 만들기패널 "염료"에서 "새로 만들기"에. 값을 입력하여 형광 이방성 (9 절)을 설정하고 드롭 다운 메뉴 "염료 모델"내 염료 모델을 선택합니다. 버튼 "로드"를 눌러 이전에 해당 위치를 선택하고 염료의 활성화 확인란을 선택합니다. 모든 안테나뿐만 아니라 모든 위성에 대해, 즉, 모든 염료에 대해이 절차를 반복합니다. 모든 염료를 생성 한 후, 측정 값을 정의합니다. 패널 "측정"에서 "새"를 클릭하여 새 측정을 만듭니다. 드롭 다운 메뉴 "Dye1"아래 "Dye2"에서의 FRET 파트너를 선택합니다. 오류가있는 smFRET 효율이 염료 쌍의 등방성의 포스터 반경을 입력합니다. 마지막으로, 측정의 활성화 확인란을 선택합니다. 모든 측정에 대해이 절차를 반복합니다. 참고 : 사용자가 혼란스러워 할 수 있도록 때때로 네트워크가 점점 복잡해진다. 예방하기 위해서는실수에서 t "네트워크 확인"버튼을 눌러 시각적으로 네트워크를 확인합니다. 그림은 활성화 된 염료를 표시하고 FRET 염료를 상호 연결 라인을 통해 측정을 나타냅니다. 14. 계산 (| 계산 모드) 계산 창을 엽니 다. 네트워크의 모든 염료 할당 된 특정 모델이있는 경우, "사용자 정의"를 선택하고 "계산"을 눌러 계산을 시작합니다. 같은 모델의 모든 염료을 가지고, 다섯 모델 (클래식, ISO, meanpos 이소, VAR-meanpos 이소 및 VAR-meanpos) 중 하나를 선택하고 계속합니다. 주 : 명령 창은 계산의 진행 상태를 표시합니다. 계산이 완료되면 고속 NPS는 팝업 메시지가 그렇게 할 것이다. 결과의 15 시각화 (| 결과보기 모델)보기 결과 창, 염료의 신뢰할 수있는 볼륨을 수출 엽니 다하기 위해. 수출 색소 밀도 : 수출단독으로 또는 모두 동시에 염료. 단일 염료 패널 "표시 염료"를 눌러 "수출 밀도"에서 선택 수출하기 위해. 해상도를 입력 (2 권장) 및 수출에 대한 파일 유형을 선택합니다. 오른쪽의 밀도는 미리하고, 수학적 특성 중 일부가 표시됩니다. 모든 염료 동시에 "일괄 내보내기"를 눌러 수출하기 위해. 키메라의 결과 밀도 파일을 엽니 다. 선택된 모델 조합의 16 일관성 검사 (| 결과보기 모델)보기 결과 창을 엽니 다. 패널 "계산 정보"텍스트 상자 "일관성"에 값보다 낮은 90 %가 표시되면 현재의 모델은 충분히 측정 smFRET 효율성을 나타내는 때문에 일관성이 없습니다. 불일치의 경우에는 버튼을 "자세한 일관성"을 누릅니다. 90 % 이하의 값이 측정을 검색합니다. 하나 이상의 색소이면S은 주로 이러한 측정치에 관여하기 때문에, 그 모델은 불일치를 일으킬 가능성이 높다. 이러한 염료 다른 염료 모델을 고려하고 빠른 NPS 계산을 다시 실행하십시오.

Representative Results

전사는 모든 생물의 유전자 발현의 첫 단계이다. 고세균에서 전사 단일 RNA 폴리머 라제 (RNAP)에 의해 수행된다. 진핵 생물에 비해 고세균 RNAP는 간단 전사 기계를 갖는 동안 자신의 진핵 대응에 눈에 띄는 구조 닮았다. 따라서 고세균는 RNA 중합 효소 II (POL II)에 의해 진핵 전사 개시를 연구하기위한 모델 시스템으로 사용할 수있다. 최근 고세균 RNA 중합 효소 열린 복합체의 전체 구조는 단일 분자 FRET 및 NPS에서 결정되었다. NPS 분석 데이터는 전사 개시의 메커니즘에 대한 유용한 정보를 제공하는 완전한 오픈 고세균 프로모터 착체의 모델을 구축 하였다. 이 구조를 해명하기 위해, smFRET 효율은 오픈 프로모터 COM 위치한 알 안테나 염료 분자 사이에서 측정했다플렉스 및 위치 결정 구조 (PDB-ID : 2WAQ)에서 알려진 RNAP, 다섯 참조 사이트에 포함 된 몇 가지 알려진 위성 염료 분자 (37). 안테나 염료 비 주형 DNA, TFB, TBP TFE 또는 다른 위치 중 하나에 장착 하였다. 본 연구에 사용 된 전체 네트워크의 60 측정 거리로 구성되었다. 도 7은 NPS 분석에서 내장 완전한 오픈 고세균 프로모터 착체의 모델을 도시한다. 그것은 이중 가닥 프로모터 DNA (빛과 진한 파란색), (회색)에 RNA 중합 효소 및 전사 개시가 (보라색) TBP 요인을 포함, TFB (녹색) 및 TFE (노란색). 모델은 전형적인 모델 (A)에서 ISO 모델 (B)을 사용하여 계산 하였다 NPS 분석 믿을만한 볼륨은 meanpos 이소 모델 (C)에서, VAR-meanpos 이소 모델의 결과와 중첩 (D) 및 VAR-meanpos 모델 (E). 그림 1 : 빠른 NPS 계산에 필요한 매개 변수의 수집 및 처리의 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : smFRET 이벤트의 실시 형광 강도의 시간 추적. smFRET, II : 도너 (녹색), 세 개의 특징적인 단계, 즉 I 나타내는 수용체 분자 (적색)의 형광 강도 도너 형광 수용체 광표백 후 III : 도너 광표백 후 배경 형광.g2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : smFRET 실험에 대한 유량 용기의 도식입니다. 흐름 챔버는 아크릴 유리 홀더와 사용자 정의 금속 홀더에 장착된다. 유동 챔버의 샌드위치 디자인은 석영 유리 (용융 실리카) 입구 및 출구 호스, 밀봉 막과 유동 챔버를 폐쇄하는 커버 슬립을 부착하기위한 구멍이 슬라이드를 포함한다. TIRF 조명의 프리즘 유동 챔버의 아래쪽에 장착된다. 중공 탭 나사는 유량 용기의 입구와 출구를 제공한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img 고도 = "그림 4"src = "/ 파일 / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg"/> 도 4 : 석영 유리 슬라이드와 밀봉 필름의 제조. 밀리미터 (주어진)의 구멍의 위치를 나타내는 석영 유리 슬라이드 기계 도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 : 유량 용기의 기계 도면. 유리 홀더 알루미늄 장착 프레임 아크릴 알루미늄 프리즘 홀더에 대한 조치는 밀리미터에 제시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. igure 6 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/> 그림 6 : smFRET 실험에 사용되는 프리즘 형 TIRF 설정의 도식 그림. 광학 부품에 대한 약어 : A, 조리개; DM, 다이크로 익 미러; F, 방출 필터; L 렌즈; M, 거울; 객관적인 O; P, 프리즘; PSD, 위치 민감한 포토 다이오드; S, 샘플; PS, 위치 단계; T, 망원경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 7 : 다른 모델 가정의 시뮬레이션 결과. 모든 사진은 고세균 RNA 중합 효소 보여 함께 프로모터 DNA (각각 tDNA과 파란색 ntDNA 및 시안)에 대한 모델 (PDB-ID 2WAQ, 상위 뷰), TBP (보라색), TFB (녹색) 및 TFE (노란색)고세균 복잡한 30을 엽니 다. 믿을만한 볼륨 (A) 전형적인 모델 (B)에서 ISO 모델 (C)를 meanpos 이소 모델 (D)가 VAR-meanpos 이소 모델 및 (E)가 VAR의 NPS 시뮬레이션 결과에 대해 중첩 -meanpos 모델입니다. 모든 볼륨은 68 % 신뢰도에 표시됩니다. 고전 및 VAR-meanpos 네트워크는 smFRET 데이터와 일치한다. 반면, 모든 염료에 대한 ISO, meanpos 이소 또는 VAR-meanpos 이소 모델 선택 네트워크는 측정 된 데이터와 일치하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

우리는 정확하게 즉 생체 거대 분자, 핵산 및 / 또는가요 성 단백질 링커를 통해 부착 염료 간의 FRET 효율성을 결정하기 위해 설정 및 실험 절차를 제시한다.

smFRET 정확한 측정 (제 3)을 보장하기 위해, 측정하는 동안 언제든지 유동 챔버로부터 공기를 배제하는 것이 중요하다. 또한, 형광체와 유량 용기를 너무 많이 넣지해야합니다. 형광 명확하게 정확한 분석을 위해 구분해야합니다. 도너의 표백 보이지 않는다 smFRET 쌍은 분석에서 제외되어야 할 바와 같이, 시야에서 분자의> 80 %가 영화의 끝에 표백 있는지 확인. 도너 및 억 셉터 채널의 크로스 토크 (cross-talk)와 상대 검출 효율 보정 샘플 β 인자 및 γ 이중의 불균일성을 고려하여 각각마다 개별적으로 계산 페어링 FRET.

<p class= "jove_content는"> 카메라 설정 (통합 시간, 전자 증 이득 전치 증폭기 이득 및 3.9 절에 설명 된 판독 레이트) 잡음비, 동적 범위 및 시간 해상도로 신호의 최적 균형을 제공하는 값으로 설정되어야한다. 서로 다른 실험하거나 상이한 하드웨어를 사용하는 경우 재조정 될 필요가있다. 프레임 번호는 도너 대부분 관측 시간 내에 표백 분자되도록 충분히 높게 할 필요가있다.

형광 분광기 (7 항 내지 9)의 측정에 대한 신호 강도 및 기록 된 데이터의 스펙트럼 해상도 간의 절충이 발견되어야한다. 이를 위해 형광 분광계의 여기 및 방출 통로의 슬릿은 사용되는 장비 및 시료 농도에 따라 적응되어야한다.

또한, 우리는 과도 또는 동적 macrom의 구조 정보를 얻기 위해 고속 NPS 분석 방법을 제시olecular 단지. NPS는 비 템플릿 DNA 가닥의 경로 및 고세균 RNA 폴리머 라제 오픈 복잡 전사 개시 인자의 위치를 나타 내기 위해 적용되었다. 60 개 이상의 서로 다른 거리 측정의 네트워크를 사용하여, 우리는 새로 구현 샘플링 엔진 (준비 EILERT, T., 베 커스, M., DRECHSLER, F., 미카엘, J.)가 장착 빨리 NPS, 보여 주었다 원래 글로벌 NPS 방법 ^(27)에 비해 크기 ≈2 수주 복잡한 smFRET 네트워크 분석에 필요한 시간을 감소시킨다. 이 알고리즘의 견고성은 병렬 템퍼링 방식과 결합 된 대도시 – 내 – 깁스 샘플러에 뿌리를두고있다. 빠른 NPS 네트워크 결과의 정확한 재현성을 보여줍니다 이전 ³⁰ 게시 된 결과와 일치한다.

몇 가지 다른 방법이 smFRET 측정 ^{(11)로부터} 구조 정보를 추론하는 것을 목표로 발표되었다 </s^업> ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^{^15,} ^{^16,} ^{^17,} ^18. 이들 접근법 모두는 하나의 특정 색소 모델을 제공한다. 따라서, 각각의 모델에서 가정을 만족하지 않는 염료가 사용될 거짓 구조 정보 발생할 수 없다. 빠른 NPS는 반대로, 각 염료 분자 다른 모델을 선택할 수 있습니다. 이 두 가지의 구조적인 동작을 설명하는 데 도움이 염료 분자 자체뿐만 아니라 그것의 부착을 위해 사용되는 링커. 상기 염료 분자의 분자량 로컬 환경뿐 아니라 물리적 특성에 가장 적합한 어느 모델을 결정한다.

고세균 개시 복합체의 분석 smFRET 네트워크의 모든 염료 분자 등방성 가정이 급격히 감소 나 리드n은 신뢰할 볼륨의 크기는 고전 모델에 비해. 모든 염료에 대한 평균 동적 위치와 함께 (95 %에서) 모든 신뢰할 볼륨 크기의 중앙값을 분자보다 0.5 내지 ^3으로 감소시킨다. 그러나 이러한 염료 분자의 포스 테리어는 가정이 잘못된 구조 정보에 리드를 한 것으로 표시, 그들의 smFRET 측정과 더 이상 일치하지 않습니다. 대조적으로, 전형적인 모델에서 결정된 포스 테리어 결정된 smFRET 효율과 일치한다.

모든 염료에 대한 평균 등방성 및 / 또는 동적 위치의 가정으로 빨리 NPS 각 염료 다섯 가지 모델 중 하나를 할당 할 수있는 염료 분자 전과을 가능하게 불일치로 이어집니다. 각 모델은 동일한 액세스 볼륨을 사용한다. 염료 AVS의 계산 알고리즘은 몇 가지 가정한다. 우선, 형광체의 공간적 형상은 구형으로 근사된다. 따라서, 직경은 계정 형광의 WID 고려일, 높이와 두께 (제 12 조)을 사용해야합니다. 또한, 상기 링커의 형태는가요 성로드에 의해 근사된다. 제 12 항에 제시된 값은 12 C 링커를 통해 부착 염료 알렉사 647에 대해 계산 하였다. 지금까지, 이는 실험 형상 주어진 정확하게 모델이 가장 적합 선험적으로 결정하는 것은 불가능하고, 따라서 모든 모델 시험해야한다. 여전히 데이터와 일치하면서 일반적으로, 하나는 가장 작은 가능한 후방 크기를 제공하는 모델을 선택한다. 모델 선택은 smFRET 데이터와 일치하는지 여부를 테스트하기 위해 사후 우도를 모두 계산한다. 일관성 후방에서 수집 한 샘플의 90 % 이상이 우도의 95 % 신뢰 구간 내에있는 것을 의미한다.

그것이 사실이지만 염료 분자 smFRET 네트워크 거리 불확실성이 작을 이방성 하부 기하학적 배열도 고려 될 필요가있다. 따라서, 잠시 연구전형적인 첫번째 선택은 ISO 모델 낮은 형광 이방성 염료 분자이다 epresenting, 일관성 검사는 올바른 염료 모델을 선택하기위한 직접적인 수단을 제공한다. 염료 모델의 최적 선택은 위치 파악 정확성의 급격한 증가를 야기 함과 동시에 그 FRET 데이터 네트워크의 일관성을 유지할 수있다.

요약하면, 빨리 NPS는 큰 거대 분자 복합체의 구조 및 동적 정보를 얻을 수 있습니다. 이러한 X 선 결정학 또는이 따라서 매우 복잡한 생물학적 과정의 기전을 이해 우리 넓어 높은가요 또는 과도 복합체를 모니터링 할 수 극저온 전자 현미경 등의 일반적인 구조 방법 대조적.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

Materials

Flowchamber preparation
Customized metall sample holder	self-built	n/a
quartz-glass slides, 76 x 26 mm	Technical Glass Products	26007
coverslips, 60 x 24 mm	Marienfeld	101242
detergent, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultra-pure water from Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto plasma cleaner	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
sealing film (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Name	Company	Catalog Number	Comments
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroic mirror, 476 RDC	Chroma	F33-476z
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic	AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm	Thorlabs
prism, PS 991	Thorlabs	PS991
focussing lens, f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
syringe pump, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 stepper motors, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelectric actuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR diode laser	Edmund Optics	CPS808	part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Varian 50	Cary		UV-VIS spectrometer
Fluorolog2	SPEX		fluorescence spectrometer
Solis (V4.15)	Andor		control software for the EM-CCD camera
Apt user utility (V1.022)	Thorlabs		control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red	Kisker Biotech		avidin-coated fluorescent multispec beads
Matlab	Mathworks		technical computing language for custon written software
Origin (V9.0)	Originlab		scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	fluorescence cuvette with 3 mm path length

Referências

Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
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Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).