Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Thilo D&#246;rfler; Tobias Eilert; Carlheinz R&#246;cker; Julia Nagy; Jens Michaelis

doi:10.3791/54782

JoVE Journal > Biochemistry

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Bioquímica

Information sur la structure à partir d'une seule molécule FRET expériences utilisant la Nano-positionnement Système rapide

Published: February 09, 2017

doi:

10.3791/54782

Thilo Dörfler*¹, Tobias Eilert*¹, Carlheinz Röcker¹, Julia Nagy¹, Jens Michaelis¹

¹Institute of Biophysics,Ulm University

Summary

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.

Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Introduction

La détermination de la structure d'une biomolécule est une condition essentielle pour la compréhension de sa fonction. Deux méthodes bien établies pour la détermination de la structure sont cryo-microscopie électronique et cristallographie aux rayons X ^{^1,} ^2. Aujourd'hui, les deux méthodes fournissent à haute résolution des informations structurelles avec une résolution jusqu'au niveau angström. Ces deux méthodes ont été largement utilisées pour élucider la structure de grandes biomolécules telles que des complexes protéiques. Bien que les méthodes existantes ont été constamment améliorées au cours des dernières décennies, la complexité des structures biologiques pose toujours un défi majeur pour la biologie structurale, en particulier lorsque de grandes, dynamiques et transitoires complexes sont étudiés ^3.

Afin d'étudier la dynamique des complexes macromoléculaires et la relation structure-fonction, en particulier, les méthodologies d'une seule molécule ont provided informations utiles ^4. Plusieurs nouvelles stratégies ont été élaborées fournissant une approche orthogonale sur l'acquisition de l'information structurelle et dynamique. Les exemples sont AFM à grande vitesse ^5, manipulation mécanique ^6, fluorescence localisation microscopie ^7, ainsi que une seule molécule de transfert Förster Resonance Energy (smFRET) ^{^8,} ^9. Depuis très tôt FRET a été appelé une règle moléculaire, en raison de la dépendance de la distance sur l'échelle de longueur de biomacromolecules ^10.

Une application particulièrement intéressante de smFRET consiste à utiliser l'information de distance obtenue à partir des mesures smFRET pour déduire des informations de structure ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ¹⁵ </sup^>, ^{^16,} ^{^17,} ^{^18,} ^{^19,} ^{^20,} ^{^21,} ^{^22,} ^23. En raison de la haute résolution temporelle de smFRET, la position des parties mobiles d'une structure protéique peut être localisée. Toutefois, afin d' en extraire des informations quantitatives de données smFRET correction des paramètres importants sur les molécules de colorant doivent être déterminés lors de la mesure ^24. Avec ces facteurs de correction, l'efficacité de FRET E _FRET peut être calculée en utilisant la formule

,

où je _A et I _D </sub> sont les intensités de fluorescence du donneur et la molécule accepteur, respectivement (voir la figure 2). Comptes Le β-facteur de la diaphonie, la fuite d'émission du donneur dans le canal accepteur et est calculée par

où I _'A et je' _D sont les intensités de fluorescence du donneur et la molécule accepteur après photo blanchiment de la molécule d'accepteur.

Γ le facteur corrige la différence dans les efficacités de détection relatif dans les deux canaux, ainsi que les différences dans le rendement quantique de fluorescence du donneur et le colorant accepteur. Il est calculé à partir de toute trace de temps individuel par

Notez que cette description néglige excitation directe de la molécule accepteur, qui devient parfois importante et aurait besoin d'être corrigée pour ainsi. Pour la détermination de ces facteurs de correction , il est utile d'exciter le donneur ainsi que l'accepteur dans un schéma alternatif ²⁵ afin de différencier entre les changements de photo-physique et dynamique des structures.

Afin d'obtenir non seulement l' efficacité de smFRET quantitatives , mais aussi des informations structurelles quantitative, le système Nano-positionnement (NPS) a été introduit en 2008 ^26. Le nom a été choisi en fonction de ses similitudes avec le système de positionnement global par satellite (GPS). Le NPS est une technique hybride combinant smFRET et les données de cristallographie aux rayons X pour la localisation des positions de colorants inconnus dans les complexes biomacromolecular. Le cStructure rystal sert de cadre de référence et les résultats smFRET sont utilisés pour obtenir des informations de distance entre une position inconnue fluorophore (antenne) et une position connue à partir de la structure cristalline (satellite). Dans des expériences successives les distances entre l'antenne et plusieurs satellites sont mesurés et la position de l'antenne est déterminée au moyen d'une méthode d'analyse statistique rigoureuse basée sur Bayesian estimation des paramètres. Par conséquent, non seulement la position la plus probable de l'antenne est calculé, mais la distribution de l'incertitude 3D complet, la partie postérieure dite, visualisée par des volumes crédibles. En outre, NPS a été élargi pour permettre l'analyse des réseaux complets de smFRET ^27.

Le NPS a été utilisé pour résoudre un certain nombre de questions importantes dans la transcription eucaryote, à savoir le cours de l'ADN en amont, l'ADN non-modèle et l'ARNm naissant au sein de l'allongement co RNA Polymerase IImplex ^{^12,} ^28, ce qui démontre également l'effet de la transcription facteurs d' initiation ²⁶ et l'architecture dynamique d'un open-promotor complexe ^29. En outre, le NPS a été utilisé pour élucider la structure de l'Archaea complexe ouvert RNA Polymerase ³⁰ et en particulier la position du facteur initiation de la transcription TFE, qui se lie de manière compétitive à le même site que le facteur de transcription de l' allongement Spt4 / 5 ^31.

Depuis lors, un certain nombre d'approches structurelles fondées smFRET ont été publiés ^{^15,} ^{^18,} ^{^21,} ^23. Lorsque l'on compare les différentes méthodes structurelles fondées smFRET, il devient clair que la précision apparente de la méthode est fortement dépendante du choix particulier de modèles de colorant. Il faut noter quedes molécules de colorant peuvent présenter un comportement spatial et d'orientation différente en fonction de leur environnement local.

À cette fin, Fast-NPS a été introduit ^32. Fast NPS utilise un algorithme d'échantillonnage avancé réduisant les temps de calcul de manière drastique. En outre, Fast-NPS permet d'effectuer une analyse structurelle et pour chaque molécule de colorant l'utilisateur peut choisir parmi un ensemble de cinq modèles de colorants différents qui sera décrit suivant. Le modèle le plus conservateur, appelé classique, suppose que le colorant occupe une seule, mais inconnue, la position. Dans cette position, le fluorophore peut tourner librement à l'intérieur d'un cône dont la taille est déterminée à partir de son respectif (dépendant du temps) anisotropie de fluorescence. L'orientation du cône est inconnue, ce qui conduit à des incertitudes importantes lors de la conversion de l'efficacité smFRET mesurées en distances. À cet égard, le modèle est conservatrice, car elle conduira à la plus petite précision par rapport à l'autre mode de colorantls. Seulement pour les très courtes distances devrait les hypothèses retenues par le modèle classique de plomb à une détermination de la position sensiblement incorrecte. Pour les valeurs typiques de smFRET, la position correcte est toujours enfermé dans le volume relativement important crédible.

Cependant, comme une plus grande précision est souhaitable, il est important de développer et de tester des modèles de colorants alternatifs, qui pourraient aider à améliorer la précision. Si le colorant tourne beaucoup plus rapidement que sa durée de vie de fluorescence intrinsèque, le soi-disant modèle iso peut être appliqué. Ici, le facteur d'orientation k ² (nécessaire pour le calcul du rayon de Förster isotrope caractéristique ) Est fixé à 2/3. Par conséquent, les volumes calculés sont fiables presque deux ordres de grandeur par rapport à celles du modèle classique ^32. Dans le cas où le fluorophore se trouve dans un environnement qui permet non seulement rapide reorientation, mais le mouvement plus rapide sur tout son volume accessible, le modèle meanpos-iso devraient être utilisés. Dans ce modèle, le colorant de manière efficace que occupe une position moyenne, où la moyenne spatiale est représentée par une conversion de ¹⁵ minutes polynomiale. Ce modèle est applicable par exemple si le colorant (généralement hydrophobe) est fixé à une région hydrophile, par exemple, l'ADN. Application du modèle meanpos-iso conduit à une réduction supplémentaire de la taille des volumes crédibles par un facteur d'environ deux. Cependant, un colorant lié à une protéine peut se lier de manière réversible à plusieurs taches hydrophobes dans son volume stériquement accessibles (AV). Un fluorophore qui bascule instantanément entre ces régions, mais dans une région subit une rotation libre et le mouvement localisé rapide est mieux décrit par le modèle var-meanpos-iso. Pour une situation similaire dans laquelle le colorant est pas libre de faire pivoter les var-meanpos modèle applique. Plus d ÉTAILS sur ces modèles peuvent être trouvés dans notre récente publication ^32.

Ces modèles offrent un vaste répertoire pour tenir compte spécifiquement pour les différents milieux un colorant pourrait rencontrer et de les appliquer à bon escient optimise la précision de la localisation. Dans rapide NPS chaque molécule de colorant attaché à une position spécifique peut être affecté à un modèle individuel, de telle sorte que FRET-partenaires sont autorisés à avoir des modèles différents. Cela permet la modélisation sans limites et à proximité à la nature. Cependant, il est important que l'on effectue des tests statistiques rigoureux pour assurer que le résultat obtenu par la combinaison du modèle final est toujours en accord avec les données expérimentales. Ces tests sont inclus dans le logiciel rapide NPS.

Pour appliquer Fast NPS aux données expérimentales de la mesure de (seulement) trois paramètres d'entrée est nécessaire. Tout d'abord, le colorant paire isotrope Förster spécifique rayons (/54782/54782eq5.jpg "/>) Doivent être déterminés. Par conséquent, le rendement quantique (QY) du colorant donneur, les spectres d'émission de fluorescence du donneur et le spectre d'absorption de l'accepteur doivent être mesurés. Ces mesures peuvent être réalisées en en masse, en utilisant un spectromètre standard et d' un spectromètre à fluorescence standard. Pour chaque couple, le R ₀ est ensuite calculée en utilisant l'PhotochemCAD gratuit et peut être utilisé dans l'analyse SNP. Par ailleurs, les (résolu temps) anisotropies de fluorescence des molécules de colorant doivent être obtenue en utilisant une polarisation (et le temps), un spectromètre de fluorescence sensible. Toutefois, les paramètres d'entrée les plus importants pour fast NPS sont les rendements smFRET mesurés sur une installation de microscopie à fluorescence de molécule unique, comme une interne fluorescence par réflexion microscope totale (TIRFM) .

Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour obtenir des données smFRET et l' application rapide NPS (Figure 1).

Protocol

1. Conditions préalables et équipement de laboratoire REMARQUE: L'ensemble de la chambre de mesure est représentée sur la figure 3. Le sandwich-conception de la chambre de mesure comprend trois composantes principales: un glissement du verre de quartz (silice fondue), un film d'étanchéité et une lamelle qui scelle la chambre d'écoulement. La chambre de mesure est montée sur un porte-échantillon sur mesure. Les dimensions de la chambre de l'échantillon et le support métallique sont conçus pour répondre à une lame de verre de quartz microscopie standard (76 mm x 26 mm). Cut quartz des lames de verre à l' aide d' un foret de diamant (0,75 mm) à des positions indiquées sur la figure 4. La conception des lames de verre de quartz est asymétrique afin de différencier entre les deux côtés de chaque diapositive. REMARQUE: Les lames de quartz peuvent être réutilisés après la mesure jusqu'à ce que la surface est égratignée. Pour monter les chambres, utiliser des porte-échantillons de métal sur mesure comme le montre la Figure 5 </ Strong>. Les porte-échantillons contiennent deux fils (M4) afin de relier une entrée et une tubulure de sortie de la chambre d'écoulement. En outre, utiliser des fils (M3) pour monter la chambre d'échantillon sur le support métallique ainsi que des fils (M3) pour fixer le support de prisme sur la moitié inférieure du support métallique. Effectuer les mesures smFRET sur un type de prisme totale microscope à fluorescence à réflexion interne (TIRFM) (figure 6). NOTE: Le TIRFM dispose de trois lasers: Un vert (532 nm, laser Nd: YAG) et un laser rouge (643 nm, laser à diode) pour l'excitation du donneur et les molécules accepteur de colorant ainsi qu'un laser bleu (491 nm , pompé par diode laser à l'état solide) pour le blanchiment de l'arrière-plan des impuretés fluorescentes sur la chambre d'échantillon avant la mesure smFRET. Les trois faisceaux laser sont combinés dans l'espace et peuvent être sélectionnées par l'intermédiaire d'un filtre acousto-optique accordable (AOTF). La lumière de fluorescence est collectée par un objectif d'ouverture élevé, divisé en un donneur et un accepteou d'un canal à l'aide d'un miroir dichroïque et projeté sur deux caméras EM-CCD. La chambre d'échantillon est fixée à un étage micrométrique permettant un mouvement x et la direction y par deux moteurs pas à pas. Un troisième moteur piézo-électrique est utilisé en association avec un laser infrarouge et un détecteur sensible à la position pour construire un système de mise au point automatique afin d'assurer focalisation optimale tout au long de l'expérience. Utilisez alternance excitation laser (ALEX) lorsque la dynamique dans les trajectoires de temps de FRET sont observés 25. Cette dynamique peut être causée soit par des changements conformationnels dans les molécules ou par des fluctuations de luminosité de l'accepteur et accepteur clignotant. NOTE: ALEX permet la discrimination entre ces deux causes possibles et empêche une mauvaise interprétation des trajectoires de FRET dynamiques. Cependant, pour des raisons de simplicité, la partie de protocole est limité à l'analyse des films tirés sans ALEX. Attention: les lasers de classe 3B sont utilisés dans la configuration de la fluorescence une seule molécule. Veiller à ce que la adéquateles mesures de sécurité de ser, conformément aux règlements de l'administration locale, ont été prises avant que le système fonctionne. Effectuer la mesure d'absorption utilisée pour déterminer le rendement quantique sur un spectromètre UV-VIS (voir Matériels et Méthodes). Effectuer la mesure du spectre d'émission de fluorescence du donneur, le spectre d'absorption de l'accepteur et l'anisotropie de la fluorescence sur un spectromètre de fluorescence (voir Matériels et Méthodes). Préparer les chambres échantillons selon les procédures publiées 33. Sinon, la procédure décrite dans [34] peuvent être utilisés. Étiqueter les échantillons étudiés avec une paire de molécules de colorant donneur-accepteur adapté pour smFRET et faire en sorte qu'il y ait un fragment de biotine pour l'immobilisation sur la surface de la chambre d'échantillon. NOTE: Afin de localiser une position de colorant d'antenne inconnue avec le logiciel rapide NPS différentes constructions d'échantillons sont nécessaires. Chaque construction needs d'avoir une étiquette à la position de colorant d'antenne inconnue et une étiquette à une position satellite connue à partir de la structure cristalline. Au moins trois constructions différentes avec des colorants attachés à la position de l'antenne et trois positions de satellites différentes sont nécessaires pour obtenir des résultats précis. Mesures entre antennes ainsi que entre les satellites sont également utiles pour améliorer la précision, cependant, cela nécessite l'échange de molécules de colorant qui doit être correctement entré dans l'analyse. 2. Montage du débit Chambers dans un porteur personnalisée Tirez tube en silicone (0,8 mm de diamètre, 2,4 mm OD) en vis à onglet creux (M4) et couper le tuyau sur les deux extrémités droite laissant un surplomb de 1 cm sur les deux côtés à l'aide d'une lame de rasoir. Ajuster le débord de la tubulure à environ 2 mm d'un côté de la vis de l'onglet. Monter la chambre d'écoulement dans le porte-échantillon de manière à ce que les trous dans la lame de verre de quartz correspondent aux filets dans le porte-échantillon. Serrerentrée et de sortie vis doucement pour veiller à ce que l'entrée et la sortie de la chambre de l'échantillon sont encore pénétrable. Serrez légèrement les quatre vis du support de verre acrylique pour fixer la position de la chambre d'écoulement. tube Cut silicone (0,58 mm ID, 0,96 mm OD) dans 20 cm de long morceaux. Insérer une des pièces à l'entrée et à la vis de sortie de la chambre de mesure. Fermer la tubulure d'entrée et de sortie à l'aide d'une pince. REMARQUE: Les chambres d'échantillons assemblés peuvent être stockés à température ambiante pendant jusqu'à deux semaines. 3. smFRET mesure sur le Microscope FRBR Utiliser une seringue pour laver la chambre d'échantillon avec 500 pi de PBS. Empêcher les bulles d'air d'entrer dans la chambre d'échantillons à tout moment par la création d'une goutte à l'extrémité de la tubulure d'entrée avant de passer à une solution tampon différente. Vider la chambre d'échantillon avec 100 pi neutravidine (0,5 mg / ml dans le PBS) et incuber pendant 15 min à température ambiante. lavagela solution de neutravidine avec 500 ul de PBS. Visser le support métallique pour le prisme sur la chambre d'échantillon. Monter la chambre d'échantillon à l'étape du micromètre du FRBR-microscope. Assurez-vous de monter la chambre d'échantillon horizontalement aussi droite que possible en face de l'objectif d'éviter la défocalisation pendant le processus de numérisation. Démarrez le logiciel de contrôle des caméras EM-CCD et le logiciel de commande des moteurs piézoélectriques de la scène. Ajustez la mise au point de l'objectif du microscope en regardant les reflets du laser IR. Placer le prisme (PS991, n = 1,52) sur le dessus du support de prisme métallique. Ajustez la position latérale du prisme pour faire en sorte que les faisceaux laser a frappé le prisme puis utiliser un adhésif et incuber à la lumière UV pendant 5 min. REMARQUE: prisme monté peut être réutilisé par le nettoyage. Dans l ' «acquisition de configuration" logiciel de contrôle de la caméra de clic et de définir les paramètres d'acquisition suivants: 100 ms integrattemps ion, 401 images / films (caméra vert), 400 images / film (caméra rouge), multiplicateur d'électrons gagner 225, 5x de gain pré-amplificateur et lecture taux de 3 MHz à 14 bits. Créez un dossier sur le disque dur local pour la mesure. Choisissez un nom de votre choix pour les fichiers de mesure, par exemple, Année-Mois-Jour. Dans le logiciel paramètres vont à la "Auto-Save" rider, activez "Auto save" et choisissez le format de fichier * .sif pour l'acquisition de film. Sélectionnez le dossier sur le disque dur. Utilisez le nom du dossier que filestem. Activez la (valeur de démarrage à 1) de la fonction "AutoIncrement". Activer la fixation d'un opérateur au nom du fichier. Utilisez "DON" et "ACC" pour le donneur et le canal accepteur, respectivement. Choisissez "_" comme séparateur. Dans le logiciel de contrôle de la caméra, cliquez sur "Video" pour démarrer l'image en direct de la caméra et l'eau de Javel fluorescence de fond par balayage de la chambre d'échantillon en utilisant l'intensité du laser maximum de trois lasers (comcombiné ≈3,000 W / cm 2 pour 10 s par champ). Eteindre le laser bleu. Diminuer l'intensité du laser verte à environ 200 W / cm 2 et environ 40 mW / cm 2 pour le laser rouge si une alternance d' excitation laser (ALEX) est utilisé. Diluer l'échantillon fluorescent biotinylé à une concentration de 50 à 100 pM. Charge 100 ul de la solution. L'échantillon est immobilisé sur la surface de la chambre lors de la liaison. REMARQUE: Assurez-vous de ne pas surcharger la chambre. les molécules voisines doivent être séparées les unes des autres. Si nécessaire, charger un montant supplémentaire de 100 pi d'un échantillon 2x plus concentré à la chambre. Sceller le tube de la chambre de mesure à l'aide des pinces, après l'achèvement du chargement d'entrée et de sortie. Eteignez tous les lasers et utiliser les piézo-moteurs pour déplacer la chambre d'écoulement deux champs de vision plus loin. Dans le logiciel de contrôle de la caméra, cliquez sur "Prendre le signal" pour commencer l'enregistrement et le commutateur filmle laser en même temps. Faire en sorte que plus de 80% des molécules sont blanchis à la fin du film en réglant la puissance du laser. Répétez les étapes 3.17 et 3.18 pour toute la région de chambre d'échantillon préblanchis. 4. Acquisition de la Carte de transformation ( "beadmap") Préparer une chambre d'écoulement tel que décrit dans les sections 1.1, 1.2 et 2. Utilisez perles multispectrales fluorescentes avidine qui montrent une émission de fluorescence du donneur et le canal accepteur. Vortex le stock pendant 1 min, puis diluer 50 pl du stock dans 50 ul ddH 2 O. Vortex à nouveau pendant 1 min, Soniquer 1-2 min, puis un autre vortex 10 s. Effectuez les étapes décrites pour les mesures de smFRET (Section 03.05 à 03.10). Charge de 100 ul (1 volume de la chambre) de 1: 2 perles fluorescentes dilués dans la chambre d'écoulement. Attendre 10 minutes pour les billes fluorescentes de se lier à la surface. Utilisez les paramètres d'acquisition de 3,9 mais change à la longueur du film 26 (caméra vert) et 25 (caméra rouge) et le gain du multiplicateur d'électrons à 10. Régler l'intensité du laser vert à une valeur de 20 W / cm 2. Prenez un film à un champ de vision avec environ 50-100 perles. 5. Traitement et analyse des données smFRET Utilisez la coutume écrite logiciel SM FRET pour l'analyse de la beadmap (voir Matériels et méthodes) et les films acquis. Démarrez le programme viewPlot1.m. Cliquez sur Analyse | Batch Analysis, décochez l'option "ALEX" si elle n'a pas été utilisée. Pour de meilleures performances choisir le seuil de pic de conclusion «élevé». Appuyer sur OK". Choisir "NON" lorsqu'on lui a demandé si un beadmap a déjà été analysé. Parcourir le dossier contenant le beadmap acquis et sélectionnez le fichier * .sif (en double-cliquant dessus). Dans la boîte de dialogue suivante fenêtre appuyez sur "OK". NOTE: Si un beadmap a déjà analysé dans une mesure précédentement, choisissez "OUI" ici et sélectionnez le beadmap enregistré en naviguant dans le dossier approprié et double-cliquant sur le beadmap fichier * .map. Passez à l'étape 5.8. Choisissez deux perles simples positionnées dans les coins opposés du champ de vision. Les intensités des pixels sont codés par couleur du bleu foncé (intensité faible) au rouge foncé (haute intensité). Cliquer sur le centre du premier bourrelet. Si le centre de la molécule peut être situé clairement par le codage couleur, choisissez "OUI" ou cliquez sur "NON" et choisissez une paire molécule différente. Placez le réticule sur le pixel montrant l'intensité maximale et appuyez sur "GARDER". Répétez le processus avec le deuxième canal. Cliquez sur la molécule dans le coin opposé et répétez les étapes 5.5 et 5.6. NOTE: Le décalage de pixel relatif des deux canaux est affichée dans la fenêtre de commande et la carte de transformation est automatiquement enregistré en tant que fichier * .map dans le dossier contenant le beadmap * .sif fichier <./ Li> Pour charger les donneurs et accepteurs de films (* .sif) pour l ' «analyse par lots", accédez au dossier, sélectionnez tous les films qui doivent être analysées et cliquez sur "OK". Dans la fenêtre de dialogue suivante, appuyez sur "OK". NOTE: L'analyse par lots est terminée lorsque la dernière voie affichée dans la fenêtre de commande commence par "analyse fini …". Les molécules détectées sont affichées dans une nouvelle fenêtre, qui indique également le déplacement relatif du donneur et le canal accepteur déterminé à partir de la carte de transformation. Pour charger les fichiers vidéo par lots, cliquez sur Fichier | Charger. Décochez l'option "ALEX" si elle n'a pas été utilisée. Réglez le smoothwidth à 10, puis cliquez sur "OK". Choisissez le dossier contenant les fichiers .ttr * et cliquez sur "tout sélectionner" et "OK" dans le menu contextuel suivant. Si la trace affichée comporte les phases caractéristiques de smFRET (figure 2) appuyez sur le bouton à bascule "Non sélectionné" et le premiersélectionner le point de début de l'événement FRET de temps en déplaçant la ligne avec le curseur de la souris et en cliquant sur le bouton gauche de la souris. Ensuite, sélectionnez le point de la décoloration de la molécule d'accepteur et enfin le point de la décoloration de la molécule donneuse de temps de temps. Dans la fenêtre suivante de l'efficacité FRET est tracée en bleu. Pour sélectionner la presse de trace sur le bouton "Oui", sinon choisissez "Non". Pour ré-accéder à une trace de temps cliquez sur le bouton "Précédent". Répétez la procédure jusqu'à ce que la dernière molécule du film. Après avoir analysé la dernière molécule dans un film enregistrer les traces sélectionnées en cliquant sur "Fichier | Enregistrer". Enregistrer les traces sélectionnées dans le même dossier que les fichiers .sif *. Répétez les étapes de 5,10 à 5,13 pour tous les films acquis. Exécutez le programme combine_fret_results.m. Sélectionnez le dossier contenant les fichiers * .res et tous les fichiers * .FRETonly_trace. Save the FRET et frame-sage fichiers FRET molécule sage que MW.dat etFRW.dat, respectivement. REMARQUE: Les fichiers * .dat sont enregistrées sous forme de fichiers ASCII. Le fichier FRW.dat contient six colonnes et une ligne pour chaque FRET-cadre. La sixième colonne contient l'efficacité de FRET de cadre sage corrigé. Le fichier MW.dat contient 21 colonnes et une ligne par molécule FRET sélectionnée. La troisième colonne contient l'efficacité de FRET molécule sage. 6. Affichage smFRET données en histogrammes NOTE: Afin d'extraire l'efficacité smFRET moyenne de toutes les données smFRET enregistrées les données de trame-sage ou les données de molécules-wise sont tracées en histogrammes et analysées à l'aide de Gauss correspond à (multiples) pics. Dans ce qui suit, le protocole utilise un logiciel d'analyse de données commerciales (voir la liste des matériaux). Cependant, tout autre logiciel disponible peut être utilisé à la place. Ouvrez un logiciel d'analyse de données (voir la liste des matériaux). Cliquez sur Fichier | Importer | ASCII multiple. Sélectionnez le dossier contenant le fichier FRW.dat. Sélectionnez le fichier et appuyez sur "OK & #34 ;. Acceptez l'option d'entrée avec "OK" sans changement. Sélectionnez la troisième colonne C (Y) contenant l'efficacité de FRET corrigées, cliquez-droit sur la colonne et sélectionnez Plot | Statistiques | Histogramme. Dans la fenêtre de l' histogramme double-cliquez sur les colonnes et décochez "binning automatique" et sélectionnez un bac de taille désirée, par exemple, 0,05. Vous pouvez aussi choisir les valeurs de début et de fin, par exemple, -0,025 et 1,025. Sélectionnez les colonnes de l'histogramme par un clic gauche sur eux. Ensuite, faites un clic droit et choisissez "aller à Bin Feuille". Sélectionnez la colonne "Counts" par un clic gauche dessus, puis faites un clic droit et sélectionnez Plot | Colonne / Bar / Pie | Colonne. Dans la parcelle de barre de colonne aller à Analyse | Montage | ajustement de courbe non linéaire | boîte de dialogue Ouvrir. Choisissez "gaussienne" sous Fonction, puis aller à l'avenant "Paramètres". Décochez auto initialisation des paramètres. Fixer la valeur de décalage (y0) à 0. Cliquez sur "Fit". REMARQUE: La fonction d'ajustement, ainsi que le montage dequeues sont maintenant affichées dans la parcelle de colonne. La valeur "xc" donne au centre de la fonction d' ajustement, à savoir, la moyenne FRET efficacité qui sert de paramètre d'entrée pour le logiciel NPS. 7. Mesure du rendement quantique Effectuer la détermination du rendement quantique relatif à la méthode similaire à la procédure décrite par Würth et al. 35, en utilisant de la rhodamine 101 dissous dans de l' éthanol (QY = 91,5%) en tant que standard. Les spectres d'absorption d'enregistrement à un spectromètre UV-VIS à l'aide d'un volume de 80 ul dans une cuvette d'absorption de 1 cm de trajet optique. L'absorbance à la longueur d'onde qui sera utilisée pour l'excitation de fluorescence doit être ≤ 0,05. spectres d'émission d'enregistrement sur un spectromètre de lampe-étalonné fonctionnant en mode de comptage de photons. Effectuer les mesures avec polariseurs Glan-Thompson dans l'excitation (0 °) et d'émission (54,7 °) chemin (conditions d'angle magique) en utilisant un spectr Al bande passante d'environ 5 nm et 2,5 nm pour l'excitation et l'émission monochromateur, respectivement. Mesure d' échantillons après leur transfert dans une cuvette de fluorescence avec 3 mm longueur du trajet en prenant soin que le taux de comptage ne dépasse pas 10 6 s -1. Calculer le rendement quantique selon la où n et n Std sont les indices de réfraction du solvant de l'échantillon et de l'étalon, respectivement. f (λ) et f_Std (λ) sont les intensités de fluorescence de l'échantillon et la norme à la longueur d'onde λ. A (λ ex) et A std (λ ex) sont l'absorbance de l'échantillon et la référence à la longueur d' onde d'excitation et Φ std est le rendement quantique de la norme. le "> 8. Calcul de la isotrope Förster Radius Calculer le rayon isotrope Förster ( ) À partir du spectre d'émission de la molécule donneuse, le spectre d'absorption de la molécule acceptrice, le rendement quantique du donneur et de l'indice de réfraction du milieu. Utilisez le PhotochemCAD freeware pour le calcul de . Cependant tout autre logiciel disponible peut être utilisé à la place 36. 9. La mesure des anisotropies Déterminer fluorescence anisotropies l'état d' équilibre à partir d' enregistrements de spectres de fluorescence avec différents paramètres de polariseur d' excitation / émission (V / V, V / H, H / V, H / H) 36. Calculer le facteur G, qui corrige artéfact de polarisation de l'instrument, pour chaque longueur d'onde à partir de larapport et l'utiliser pour calculer la valeur d'anisotropie pour chaque longueur d'onde: où I xy indique l'intensité d'excitation de polarisation x et la polarisation d'émission y. La moyenne des valeurs sur toute la gamme d'émission spectrale pour calculer la anisotropie de fluorescence d'état stable. 10. Installation de la Fast-NPS Software Télécharger UCSF Chimera de http://www.cgl.ucsf.edu/chimera et suivez le guide d'installation. Allez sur le site de l ' «Institut de biophysique"à l'Université de Ulm: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Télécharger la version actuelle de Fast NPS et l'extraire dans un dossier de votre choix. Ouvrez le sous-dossier "redistribuable" et installer le Visual C ++ Redistributable qui est approprié pour le système. 11. Centrer le fichier pdb Ouvrez le fichier pdb (s) d'intérêt pour Chimera. Sélectionnez tous les atomes du complexe macromoléculaire et calculer les coordonnées du barycentre (Outils | Structure Analyse | Haches / Avions / Centroïdes | Définir barycentre … | Ok). Ouvrez le journal Répondre (Favoris | Répondre Log) et l'outil de transformation (Outils | Mouvement | Transformer les coordonnées). Entrez les coordonnées du barycentre montré dans la réponse Connectez-vous à la zone de texte "Shift" de la fenêtre Transformer les coordonnées et changer le signe de tous les coordonner. Appuyez sur "Appliquer" et enregistrez le fichier avec "Enregistrer PDB" (Fichier | Enregistrer PDB). 12. Réglageles prieurs de position NOTE: Toutes les valeurs sont prises en compte dans angström. Démarrez le langage informatique technique et à modifier le dossier en cours dans le dossier rapide NPS local. Entrez dans la fenêtre de commande: FastNPS. Créer un nouveau jobfile dans le gestionnaire de projet (Projet | Nouveau). Mettre en place la position avant (Outils | Modèle colorant avant). Dans le panneau "bases antérieures" définir la résolution spatiale de la position avant en entrant sa valeur (2 est recommandé). Exclure l'intérieur de la macromolécule en activant la case à cocher et en cliquant sur le bouton "PDB de charge". Sélectionner et charger le fichier pdb centré comme décrit dans la section 11. Spécifiez le diamètre approximatif (13 Å est recommandé, voir la discussion) du colorant en entrant sa valeur. Entrez une distance de squelettisation, à savoir, la distance de la molécule de colorant peut pénétrer dans la macromolécule (2 Å est recommandé). dans lepanneau "taille maximale avant" entrer les coordonnées minimales et maximales de la position avant (recommandé: x dans [-150,150], y dans [-150,150] et z [-150,150]). Lors de la définition d'un satellite, activez la case à cocher «attachement via lieur flexible" dans le panneau "bases avant" et entrez dans le panneau "linker" les coordonnées de l'atome (dans le fichier pdb centré) au cours de laquelle la molécule de colorant est attaché. En outre, spécifier la longueur et le diamètre du lieur en entrant leurs valeurs (13 Å et 4,5 Å sont recommandées, voir la discussion). Dans le cas d'une antenne ignorer ce point. Appuyez sur le bouton "calculer le volume accessible". Enregistrer la position avant et éventuellement exporter à des fins de visualisation à l'aide de logiciels tels que Chimera. 13. Définition de la géométrie du réseau Ouvrez la fenêtre Définir Mesure (Mode | Modifier la géométrie). Créer une nouvelle molécule de colorant en appuyant sur la crossesur "Nouveau" dans le panneau "Colorants". Réglez son anisotropie de fluorescence (Section 9) en entrant une valeur et sélectionnez un modèle de colorant dans le menu déroulant "modèle Dye". Appuyez sur le bouton "Load", sélectionnez la position correspondante avant et cochez la case à cocher d'activation du colorant. Répétez cette procédure pour tous les colorants, à savoir, pour toutes les antennes, ainsi que pour tous les satellites. Après la création de tous les colorants, définir les mesures. Créer une nouvelle mesure en cliquant sur "Nouveau" dans le panneau "Mesures". Sélectionnez ses partenaires de FRET dans les menus déroulants "Dye1" et "Dye2" ci-dessous. Entrer l'efficacité smFRET avec l'erreur et le rayon de Förster isotrope de cette paire de colorant. Enfin, cochez la case à cocher d'activation de la mesure. Répétez cette procédure pour toutes les mesures. REMARQUE: Souvent, le réseau devient de plus en plus complexe, de sorte que l'utilisateur peut se confondre. Afin de prévent erreurs, vérifier visuellement le réseau en appuyant sur le bouton "Check Network". La figure affiche les colorants activés et indique les mesures par les lignes reliant les colorants FRET. 14. Calcul Ouvrez la fenêtre de calcul (Mode | Calcul). Si chaque colorant dans le réseau dispose d'un modèle spécifique assigné, sélectionnez "défini par l'utilisateur" et lancer le calcul en appuyant sur "Calcul". Pour avoir tous les colorants dans le même modèle, sélectionnez l'un des cinq modèles (classique, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso et var-meanpos) et continuer. REMARQUE: La fenêtre de commande indique la progression du calcul. Fast NPS fera avec un message pop-up, lorsque le calcul est terminé. 15. Visualisation des résultats Pour exporter les volumes crédibles des colorants, ouvrez la fenêtre Voir les résultats (modèle | Voir les résultats). densités de colorants d'exportation: Exportationdes colorants seuls ou tous en même temps. Pour exporter un seul colorant sélectionner dans le panneau "Colorants affiché" et appuyez sur "Densité d'exportation". Entrez une résolution (2 est recommandé) et choisissez un type de fichier pour l'exportation. Sur la droite, la densité est prévisualisé et certaines de ses caractéristiques mathématiques sont présentées. Pour exporter tous les colorants poussent simultanément "Batch Export". Ouvrez les fichiers de densité résultant de Chimera. 16. Vérification de la cohérence de la combinaison choisie Modèle Ouvrez la fenêtre Voir les résultats (modèle | Voir les résultats). Si dans le panneau "Calcul Info" la zone de texte "Cohérence" affiche une valeur inférieure à 90% le modèle actuel ne représente pas les rendements de smFRET mesurées suffisamment et est donc incompatible. En cas d'incompatibilité sur le bouton "Cohérence détaillée". Rechercher pour les mesures qui ont une valeur inférieure à 90%. Si un ou plusieurs colorantss sont principalement impliqués dans ces mesures, leurs modèles sont susceptibles de provoquer l'incompatibilité. Considérons les modèles de colorants différents pour ces colorants et relancez le calcul rapide NPS.

Representative Results

La transcription est la première étape dans l'expression du gène dans tous les organismes. Dans les archéobactéries, la transcription est effectuée en une seule ARN polymérase (RNAP). Par rapport aux eucaryotes, l'RNAP Archaea une ressemblance structurelle frappante avec leurs homologues eucaryotes tout en ayant un mécanisme de transcription simple. Ainsi, les archées peut être utilisé comme système modèle pour étudier eucaryote initiation de la transcription par l'ARN polymerase II (Pol II). Récemment, l'architecture complète du complexe ouvert Archaea ARN polymérase a été déterminée à partir d'une seule molécule FRET et NPS. Les données de l'analyse NPS a été utilisé pour construire un modèle de l'Archaea complexe promoteur ouvert complet, qui fournit des indications utiles sur le mécanisme d'initiation de transcription. Pour élucider cette structure, l'efficacité smFRET ont été mesurées entre les molécules de colorant d'antenne inconnus situés dans le promoteur ouvert complex et plusieurs molécules de colorant par satellite connus qui ont été incorporés dans cinq sites de référence dans le RNAP, dont les positions sont connues des structures cristallographiques (pdb-ID: 2WAQ) 37. Les colorants d'antenne sont fixés à l'une des positions différentes sur l'ADN non matrice, TFB, TBP ou TFE. Le réseau complet utilisé dans cette étude a consisté à plus de 60 distances mesurées. La figure 7 illustre le modèle de l'Archaea complexe complet de promotor ouvert construit à partir de l'analyse NPS. Il comprend la double promotor brin d'ADN (bleu clair et bleu foncé), l'ARN polymérase (gris) et l'initiation de la transcription des facteurs TBP (violet), TFB (vert) et TFE (jaune). Le modèle se superpose avec les résultats de l'analyse NPS, les volumes crédibles, qui ont été calculés en utilisant le modèle classique (A), le modèle d'iso (B), le modèle meanpos-iso (C), le modèle var-meanpos-iso (D) et les var-meanpos modèle (E). Figure 1: Flux de l'acquisition et le traitement des paramètres nécessaires pour le calcul rapide NPS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Des exemples de l' intensité de fluorescence trace temporelle d'un événement smFRET. Les intensités de fluorescence du donneur (vert) et la molécule accepteur (rouge) montrant les trois phases caractéristiques, à savoir I: smFRET, II: fluorescence donneur après accepteur photoblanchiment, III: fond fluorescence après photoblanchiment donneur.g2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: Représentation schématique de la chambre d'écoulement pour des expériences smFRET. La chambre d'écoulement est monté sur un support métallique sur mesure avec des supports en verre acrylique. Le sandwich de configuration de la chambre d'écoulement comprend un verre de quartz (silice fondue) coulissent avec deux trous pour la fixation entrée et de sortie des tubes, un film d'étanchéité et une lamelle qui ferme la chambre d'écoulement. Le prisme pour l'éclairage TIRF est monté sur la moitié inférieure de la chambre d'écoulement. vis de l'onglet creux fournissent les entrées et sorties de la chambre d'écoulement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt = "Figure 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /> Figure 4: Préparation de la lame de verre de quartz et le film d'étanchéité. étirage mécanique de la lame de verre de quartz indiquant les positions des trous (exprimée en millimètres). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5: dessin mécanique de la chambre d'écoulement. Les mesures pour le porte-prisme en aluminium, acryl supports de verre et cadre de montage en aluminium sont en millimètres. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. igure 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/> Figure 6: Représentation schématique de la configuration de la FRBR type de prisme utilisé pour des expériences smFRET. Les abréviations pour les composants optiques: A, ouverture; DM, miroir dichroïque; F, filtre d'émission; L lentille; M, miroir; O, objective; P prisme; PSD, sensible à la position photo-diode; S, échantillon; PS, étape de positionnement; T, télescope. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 7: Les résultats de simulation des différentes hypothèses du modèle. Toutes les photos montrent l'ARN Archaea polymérase (pdb-ID: 2WAQ, vue de dessus) ainsi que le modèle de promoteur d'ADN (ADNt et ntDNA en bleu et cyan, respectivement), TBP (violet), TFB (vert) et TFE (jaune)dans le Archaea ouvrir complexe 30. Les volumes crédibles sont superposés pour les résultats de simulation NPS de (A) le modèle classique, (B) le modèle iso, (C) le modèle meanpos-iso, (D) le modèle var-meanpos-iso et (E) le var -meanpos modèle. Tous les volumes sont présentés à 68% de crédibilité. Le classique et les réseaux var-meanpos sont cohérentes avec les données smFRET. En revanche, les réseaux où pour tous les colorants iso, meanpos-iso ou le modèle var-meanpos-iso est choisi sont incompatibles avec les données mesurées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous présentons la procédure d'installation et expérimentale pour déterminer avec précision l' efficacité de FRET entre les colorants fixés par l' intermédiaire des linkers flexibles à biomacromolecules, à savoir, les acides nucléiques et / ou des protéines.

Afin d'assurer des mesures de smFRET précises (section 3), il est crucial d'exclure l'air de la chambre d'écoulement à tout moment pendant la mesure. De plus, assurez-vous de ne pas surcharger la chambre d'écoulement avec des fluorophores. Les fluorophores doivent être clairement séparés pour assurer une analyse correcte. Comme paires smFRET, qui ne présentent pas de blanchiment du donneur doivent être exclus de l'analyse, assurez-vous que> 80% des molécules dans le champ de vision sont blanchis à la fin du film. Pour tenir compte des hétérogénéités de l'échantillon de la β-facteur et le γ-facteur, en corrigeant la diaphonie et le rapport d'efficacité de détection du canal de donneur et accepteur, respectivement, sont calculées pour chaque paire de FRET individuellement.

<p class= "Jove_content"> Les réglages de l'appareil (temps d'intégration, le gain de multiplicateur d'électrons, de gain pré-amplificateur et taux de lecture décrit dans la section 3.9) doit être réglé sur des valeurs donnant le meilleur compromis entre le rapport signal sur bruit, la plage dynamique et résolution temporelle. Ils doivent être réajustés pour différentes expériences ou si un matériel différent est utilisé. Le nombre de trames doivent être suffisamment élevée pour assurer que la plupart des molécules du donneur agent de blanchiment dans le temps d'observation.

Pour les mesures sur le spectromètre de fluorescence (articles 7 à 9) un bon compromis entre l'intensité du signal et la résolution spectrale des données enregistrées doit être trouvée. À cette fin, les fentes dans la voie d'excitation et d'émission du spectromètre à fluorescence doivent être adaptées dépendant de l'instrument utilisé et de la concentration de l'échantillon.

En outre, nous présentons la méthode d'analyse rapide NPS pour obtenir des informations structurales de MACROM transitoire ou dynamiquecomplexes olecular. NPS a été appliqué pour révéler le trajet du non-matrice de brin d'ADN et la position de facteurs d'initiation de transcription dans le complexe ouvert d'ARN polymérase d'archéobactéries. En utilisant le réseau de plus de 60 mesures de distance différentes, nous avons montré que Fast NPS, équipé d'un moteur d'échantillonnage nouvellement mis en œuvre (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. en préparation), réduit le temps nécessaire à l'analyse de ce réseau complexe smFRET ≈2 par ordres de grandeur, par rapport à la méthode de NPS ²⁷ global d' origine. La robustesse de l'algorithme est ancré dans un échantillonneur Metropolis-dans-Gibbs combiné avec un système de trempe parallèle. Fast NPS montre la reproductibilité exacte des résultats du réseau et est compatible avec les résultats publiés précédemment ^30.

Plusieurs méthodes différentes ont été publiées visant à déduire des informations structurelles à partir des mesures smFRET ¹¹ </s^up>, ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^{^15,} ^{^16,} ^{^17,} ^18. Toutes ces approches fournissent un seul modèle de colorant spécifique. Ainsi, les colorants, qui ne remplissent pas les hypothèses faites par le modèle respectif, ne peuvent pas être utilisés ou conduisent à des informations structurales faux. NPS rapide, au contraire, permet de choisir pour chaque molécule de colorant d'un modèle différent. Cela contribue à expliquer le comportement conformationnel différent des deux, la molécule de colorant elle-même, ainsi que l'agent de liaison utilisé pour sa fixation. Les environs moléculaires locaux de la molécule de colorant, ainsi que ses propriétés physiques détermineront quel modèle est le plus approprié.

Pour le réseau smFRET analyse du complexe d'initiation archéobactéries, une hypothèse isotrope pour toutes les molécules de colorant conduit à une diminution drastique in la taille des volumes crédibles par rapport au modèle classique. En combinaison avec une position dynamique en moyenne pour toutes les molécules de colorant la médiane de toutes tailles de volume crédibles (à 95%) se réduit à moins de 0,5 nm ^3. Cependant, ces postérieurs molécules de colorant ne correspondent plus sont avec leurs mesures de smFRET, indiquant que les hypothèses retenues conduisent à des informations structurelles faux. En revanche, les dents postérieures déterminées dans le modèle classique sont compatibles avec les rendements déterminés smFRET.

Comme l'hypothèse de la position isotrope et / ou dynamique en moyenne pour tous les colorants conduisent à des incohérences, Fast-NPS permet prieurs de molécules de colorant dans lequel chaque colorant peut être attribué l'un des cinq modèles. Chaque modèle utilise le même volume accessible. L'algorithme pour le calcul de l'AVS de colorant fait plusieurs hypothèses. Dans un premier temps, la forme spatiale du fluorophore est approximée par une sphère. Ainsi, un diamètre en tenant compte de la wid du fluorophoree, la hauteur et l'épaisseur doivent être utilisés (article 12). En outre, la forme du segment de liaison est approchée par une tige flexible. Les valeurs présentées dans l'article 12 ont été calculés pour le colorant Alexa 647 fixé par l'intermédiaire d'un lieur 12-C. À ce jour, il est impossible de déterminer avec précision, a priori, quel modèle est le plus adapté, étant donné une géométrie expérimentale, et donc tous les modèles doivent être testés. En général, on choisira le modèle qui donne la plus petite taille possible postérieure, tout en étant compatible avec les données. Pour tester si un choix de modèles est compatible avec les données smFRET, on calcule à la fois la partie postérieure et la probabilité. signifie que plus de consistance 90% des échantillons prélevés dans la partie postérieure est dans l'intervalle de confiance à 95% de la probabilité.

Bien qu'il soit vrai que les arrangements géométriques du plus bas de l'anisotropie, plus l'incertitude de distance dans un réseau de smFRET des molécules de colorants doivent également être pris en compte. Ainsi, tandis que representing molécules de colorant avec une faible anisotropie de fluorescence avec un modèle d'iso est un premier choix typique, le test de cohérence fournit un moyen plus direct pour sélectionner le modèle de colorant correct. Le choix optimal des modèles de colorant peut conduire à une augmentation drastique de la précision de la localisation et en même temps conserver la cohérence du réseau avec ses données FRET.

Pour résumer, Fast-NPS permet d'obtenir des informations structurales et dynamiques des grands complexes macromoléculaires. Contrairement aux méthodes structurelles communes telles que la cristallographie aux rayons X ou par microscopie électronique de cryo ce qui permet de surveiller des complexes très souples ou transitoires, ce qui élargit considérablement notre compréhension des mécanismes de processus biologiques complexes.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

Materials

Flowchamber preparation
Customized metall sample holder	self-built	n/a
quartz-glass slides, 76 x 26 mm	Technical Glass Products	26007
coverslips, 60 x 24 mm	Marienfeld	101242
detergent, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultra-pure water from Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto plasma cleaner	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
sealing film (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Name	Company	Catalog Number	Comments
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroic mirror, 476 RDC	Chroma	F33-476z
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic	AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm	Thorlabs
prism, PS 991	Thorlabs	PS991
focussing lens, f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
syringe pump, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 stepper motors, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelectric actuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR diode laser	Edmund Optics	CPS808	part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Varian 50	Cary		UV-VIS spectrometer
Fluorolog2	SPEX		fluorescence spectrometer
Solis (V4.15)	Andor		control software for the EM-CCD camera
Apt user utility (V1.022)	Thorlabs		control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red	Kisker Biotech		avidin-coated fluorescent multispec beads
Matlab	Mathworks		technical computing language for custon written software
Origin (V9.0)	Originlab		scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	fluorescence cuvette with 3 mm path length

Referências

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Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).