Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
a citotoxicidade das células NK é uma medida utilizada para determinar o efeito de uma intervenção externa sobre a função da célula NK. No entanto, a precisão e reprodutibilidade deste ensaio pode ser considerado instável, quer devido a erros do utilizador ou por causa da sensibilidade das células NK para manipulação experimental. Para eliminar estes problemas, um fluxo de trabalho que eles se reduz a um mínimo foi estabelecida e é apresentada aqui. Para ilustrar, obtivemos amostras de sangue, em vários momentos, desde corredores (n = 4), que foram submetidos a uma intensa sessão de exercício. Primeiro, as células NK são simultaneamente identificados e isolados através de marcação de CD56 e de triagem magnética baseada, directamente a partir de sangue inteiro e de tão pouco como um mililitro. As células NK são ordenados removido de quaisquer anticorpos de reagentes ou de nivelamento. Eles podem ser contados, a fim de estabelecer uma contagem de células NK precisa por mililitro de sangue. Em segundo lugar, as células NK (células efectoras ordenados ou E) pode ser misturado com 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) marcaram células K562 (células alvo ou T) a um ensaio-óptima de 1: 5 razão T: E, e analisadas usando um imaging fluxo-citómetro que permite a visualização de cada evento e a eliminação de qualquer falsa positiva ou falsos negativos (como doublets ou células efetoras). Este fluxo de trabalho pode ser completada em cerca de 4 h, e permite a resultados muito estáveis mesmo quando se trabalha com amostras humanas. Quando disponíveis, as equipes de pesquisa pode testar várias intervenções experimentais em seres humanos, e comparar as medidas em toda a vários pontos de tempo, sem comprometer a integridade dos dados.
Introduction
células assassinas naturais são um elemento essencial do sistema imune inato. Embora eles são muito regulado, eles têm a capacidade de reconhecer e eliminar células anormais através de contacto célula-a-célula e sem activação prévia 1. Como tal, eles formam uma linha rápida de defesa contra as infecções. O exercício, especialmente intensa, tem sido demonstrado para deprimir o sistema imunitário de forma transiente 2, 3, 4, 5. As células NK são particularmente propensos para este efeito 4, 6, 7, de forma eficaz criar uma janela de aumento da sensibilidade à doença. Assim, o estudo de intervenções antes, durante ou após o exercício intenso com o objetivo de reduzir o seu impacto sobre a função das células NK é de particular interesse para o bem-estar dos atletas pós-competições.
<p class= "jove_content"> No entanto, o estudo de tais intervenções é complicada por vários factores: 1) As células NK são escassas 8, a cerca de 1% do compartimento de células brancas do sangue; 2) As células NK são muito sensíveis ao stress e dependem de exposição constante a condições fisiológicas para permanecer viável e estável no decurso da experimentação; e 3) ensaios padrão para determinar a citotoxicidade das células NK, como Ficoll gradientes 9 e solte ensaios de 10, não são confiáveis e inconsistente. A variabilidade inerente de amostras humanas único composto estas questões. amostras humanas frescas colhidas durante as intervenções são bastante regulamentado e difícil de obter, pelo menos, quando comparado com as amostras de animais ou linhas celulares imortalizadas. Isso reduz as oportunidades para repetir experiências ou adicionar participantes para o estudo de coorte para alcançar limiares estatísticos significativos. Coletivamente, estas questões apoiar a necessidade de um protocolo simplificado que permite foR tanto de alto rendimento e uma análise de alta fiabilidade da actividade lítica de células NK em amostras humanas.Nós estabelecemos um fluxo de trabalho que encurta o tempo necessário para identificar, isolar e células NK teste de sangue total humano, minimizando a exposição a factores externos. O método de optimizar o uso de dois instrumentos, um separador magnético à base de células e um fluxo de imagens citómetro, e, um T específica optimizado-ensaio: razão E para permitir a detecção das diminuições ou aumentos de citotoxicidade de células NK.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito neste estudo mede directamente a actividade específica de células NK de um indivíduo em resposta a estímulos (neste caso particular, o exercício prolongado). Tipicamente, as células NK são isolados a partir de um do sangue utilizando um gradiente de densidade ou de triagem de células, usando uma combinação de marcadores. Embora estes métodos sejam largamente usadas, elas têm muitas desvantagens: eles são morosos, envolvem manipulações múltiplas, e dependem fortemente do usuário. Como …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
Referências
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).
