Zika वायरस संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली और<em> इन विट्रो</em> इंटरफेरॉन की रोगनिरोधी प्रभाव
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika वायरस (ZIKV) एक उभरती हुई रोगज़नक़ कि इस तरह के microcephaly, नेत्र दोष, और बिगड़ा विकास के रूप में भ्रूण विकास संबंधी असामान्यताएं से जुड़ा हुआ है। ZIKV Flaviviridae परिवार के एक शाही सेना वायरस है। ZIKV मुख्य रूप से मच्छरों से फैलता है, लेकिन यह भी भ्रूण ऊर्ध्वाधर संचरण के साथ ही यौन संपर्क करने के लिए मातृ से फैल सकता है। तिथि करने के लिए, वहाँ वायरस से संक्रमित लोगों की रक्षा करने के लिए उपलब्ध कोई विश्वसनीय उपचार या टीका विकल्प हैं। एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, प्रभावी Zika वायरस संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली के विकास ZIKV प्रतिकृति के साथ ही दवा और टीका विकास की आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इस संबंध में एक प्रोटोकॉल एक स्तनधारी सेल आधारित इन विट्रो Zika वायरस संस्कृति वायरल उत्पादन और विकास के विश्लेषण के लिए प्रणाली का वर्णन यहां सूचना दी है। एक सेल monolayer और वायरल अनुमापांक को मापने के लिए पट्टिका परख पर Zika वायरस से सजीले टुकड़े के गठन पर विवरण प्रस्तुत कर रहे हैं। वायरल जीनोम प्रतिकृति कैनेटीक्सऔर डबल असहाय आरएनए जीनोम replicatory मध्यवर्ती निर्धारित कर रहे हैं। यह संस्कृति मंच इंटरफेरॉन α (IFN-α) की पहचान करने में जिसके परिणामस्वरूप साइटोकिन्स के एक छोटे से सेट के एक पुस्तकालय के खिलाफ स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया गया था, IFN-β और Zika वायरल विकास की प्रबल अवरोधकों के रूप में IFN-γ। सारांश में, इन विट्रो संक्रामक Zika वायरल संस्कृति प्रणाली और विभिन्न विषाणुजनित assays इस अध्ययन है, जो संभावित बहुत आगे वायरल रोगजनन के तंत्र और वायरल डाह के विकास elucidating में अनुसंधान समुदाय के लाभ के लिए है, में प्रदर्शन कर रहे हैं। एंटीवायरल IFN-अल्फा आगे एक रोगनिरोधी, बाद जोखिम रोगनिरोधी, और उपचार के उच्च जोखिम आबादी में Zika वायरस के संक्रमण, संक्रमित गर्भवती महिलाओं सहित के लिए विकल्प के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है।
Introduction
Zika वायरस (ZIKV) एक महत्वपूर्ण मानव microcephaly और गरीब गर्भावस्था के परिणामों 1,4 के साथ जुड़े रोगज़नक़ है। ZIKV चिकित्सकीय प्रासंगिक flaviviruses कि इस तरह के डेंगू, पश्चिम नील नदी, और सेंट लुइस में इन्सेफेलाइटिस वायरस के रूप में मस्तिष्क संबंधी दोष उत्पन्न कर सकते हैं के सेट के अंतर्गत आता है। वायरल संचरण के मुख्य मोड इसके अलावा, यौन संचरण भी 5,6 सूचित किया गया है मच्छर एडीज एजिप्टी वेक्टर के द्वारा होता है, और। ZIKV मच्छर वेक्टर के विस्तार भौगोलिक वितरण और जन्म दोष के साथ अपने मजबूत संबंध के कारण एक प्रमुख वैश्विक स्वास्थ्य मुद्दा बन गया है। ZIKV पहले Zika जंगल में एक प्रहरी रीसस बंदर से 1947 में अलग किया गया था, युगांडा और पहले मानव मामला 1952 में 7.8 की सूचना मिली थी। लोग कहते हैं कि इस तरह के बुखार, व्यग्रता, सिर दर्द, नेत्रश्लेष्मलाशोथ, और मांसपेशियों / जोड़ों के दर्द के रूप में हल्के लक्षण के साथ मौजूद ZIKV से संक्रमित हो जाते हैं। संक्रमित गर्भवती महिलाओं को भ्रूण के विकास के लिए 1 ZIKV हस्तांतरित कर सकते हैं। जेडIKV संक्रमण भी Guillain-Barre सिंड्रोम, एक परिधीय तंत्रिका ऑटो प्रतिरक्षा माइलिन रहित विकार 9 से जोड़ा गया है।
Zika वायरल जीनोम एक सकारात्मक भावना, एकल असहाय आरएनए अणु जो लंबाई में 10.8 बारे में kilobases है के होते हैं। जीनोम की संरचना, गैर-कोडिंग क्षेत्रों (एनसीआर) के साथ 5'NCR-सी पी आर एम-ए-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A -2 k-NS4B-NS5-3'NCR के रूप में आयोजित किया जाता है एक प्रोटीन कोडिंग क्षेत्र flanking 6। एक एकल polyprotein (3,419 हूँ) अनुवाद किया है कि सह और बाद translationally 10 छोटे पेप्टाइड में cleaved है। दोनों 5'NCR और 3'NCR आरएनए स्टेम पाश संरचनाओं वायरल जीनोम अनुवाद और नकल के प्रारंभ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जीनोम के संरचनात्मक घटकों कैप्सिड, झिल्ली, और लिफाफा प्रोटीन के शामिल हैं। गैर-संरचनात्मक प्रोटीन जीनोम प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण हैं।
वर्तमान में, Zika वायरल उपभेदों तीन मुख्य जीनोटाइप में बांटा जाता है: पश्चिम अफ्रीकीपूर्वी अफ्रीकी और एशियाई 6,10-13। यह प्रस्ताव किया गया है कि पूर्वी अफ्रीकी वंश पश्चिम अफ्रीका और एशिया में, जहां बाद में इसे आगे विकसित करने के लिए 12 फैल गया। एशियाई जीनोटाइप अमेरिका में वर्तमान फैलने के लिए जिम्मेदार है। Zika वायरस दोनों मच्छर और स्तनधारी कोशिकाओं में संवर्धित किया जा सकता है। प्राथमिक त्वचीय fibroblasts, अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं, cortical तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं, और वेरो कोशिकाओं Zika वायरल संक्रमण 10,14,15 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। दोनों प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय इंटरफेरॉन त्वचा fibroblasts 15 में ZIKV वृद्धि को सीमित करने के लिए दिखाया गया है। इस अध्ययन के उद्देश्यों उत्पादन और एशियाई जीनोटाइप Zika वायरल तनाव PRVABC59 की परख करने की क्रिया एक स्तनधारी सेल संस्कृति प्रणाली में एक कदम वार, विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने और एक दवा के विकास मंच के रूप में इस संक्रामक संस्कृति प्रणाली की उपयोगिता का प्रदर्शन कर रहे हैं। इस संसाधन के संभावित बहुत Zika वायरल और तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान समुदाय आगे मैं स्पष्ट करने के लिए लाभ के लिए हैवायरल रोगजनन और वायरल डाह के विकास के टीएस तंत्र।
Protocol
Representative Results
Discussion
इधर, इन विट्रो में Zika वायरस संवर्धन के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। , सहित वायरस संस्कृति का विस्तार, अनुमापांक मापने, और जीनोम प्रतिकृति बढ़ाता प्रदान किया गया के लिए इष्टतम अंत अ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
Referências
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