पानी के नमूने निस्पंदन और पर्यावरण डीएनए की निकासी के लिए एक फिल्टर कारतूस का प्रयोग करें
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
पर्यावरण डीएनए (एडना) जलीय वातावरण में पानी स्तंभ में पाया आनुवंशिक सामग्री को दर्शाता है। हाल के अध्ययनों से, तालाबों 1-3, 4-8 नदियों सहित विभिन्न जलीय वातावरण, से मछलियों का पता लगाने के लिए एडना की उपयोगिता का प्रदर्शन किया धाराओं 9, और समुद्री जल 10-14। इन अध्ययनों में से अधिकांश, एक या कुछ आक्रामक 1,4-6,8,14 और दुर्लभ या संकटग्रस्त प्रजाति 3,9 का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित है, जबकि कुछ हाल के अध्ययनों से स्थानीय मछली समुदायों 7.9 में कई प्रजातियों के एक साथ पता लगाने का प्रयास 12,13,15 और mesocosms 11,12।
बाद दृष्टिकोण "metabarcoding" कहा जाता है और एडना metabarcoding पीसीआर प्राइमरों के एक या एकाधिक सेट का उपयोग करता है taxonomically विविध नमूने भर में एक जीन क्षेत्र coamplify करने के लिए। इस अनुक्रमण और एडाप्टर अलावा के साथ पुस्तकालय तैयारी द्वारा पीछा किया जाता है, और इंडेक्स पुस्तकालयों एक उच्च throughput समानांतर अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैंमंच। हाल ही में मिया एट अल। 12 मछलियों ( "MiFish" कहा जाता है) से एडना metabarcoding के लिए सार्वभौमिक पीसीआर प्राइमरों विकसित की है। MiFish प्राइमरों mitochondrial 12S rRNA जीन (163-185 बीपी) है, जो वर्गीकरण परिवार, वंश और कुछ निकट से संबंधित congeners के लिए छोड़कर प्रजातियों के लिए मछलियों की पहचान करने के लिए पर्याप्त जानकारी शामिल की एक hypervariable क्षेत्र को लक्षित। एडना metabarcoding में उन प्राइमरों के उपयोग के साथ, मिया एट अल। 12 मछलीघर के पास ज्ञात प्रजातियों की संरचना और प्रवाल भित्तियों के साथ मछलीघर टैंक से 230 से अधिक उपोष्णकटिबंधीय समुद्री प्रजातियों का पता चला।
metabarcoding प्रोटोकॉल के अनुकूलन मछलियों से एडना एकाग्रता के स्तर पर अलग से प्राकृतिक समुद्री जल को समायोजित करने के लिए करते हैं, हमने देखा है कि MiFish प्राइमरों कभी कभी बाद में पुस्तकालय तैयारी के लिए लक्ष्य क्षेत्र बढ़ाना करने में विफल रहा। इस असफल पीसीआर प्रवर्धन के लिए और अधिक होने की संभावना कारणों में से एक ते की पर्याप्त मात्रा की कमी हैmplate डीएनए पानी की छोटी मात्रा में छान में निहित है (यानी 1-2 एल)। हालांकि एक विशिष्ट वर्गीकरण समूह से एडना एकाग्रता, बड़ी पानी की मात्रा (> 1-2 एल) के निस्पंदन प्रवर्धन से पहले अज्ञात है दुर्लभ मछली बहुतायत और बायोमास, जैसे के साथ जलीय वातावरण से अधिक एडना इकट्ठा करने के लिए एक सरल और प्रभावी का मतलब होगा खुले समुद्र और गहरे समुद्र में पारिस्थितिक तंत्र।
डिस्क फाइबर फिल्टर के सापेक्ष पारंपरिक मछली एडना अनुसंधान 16 की संख्या में इस्तेमाल किया, फिल्टर कारतूस 17 clogging से पहले बड़ा जल की मात्रा को समायोजित करने में फायदा है। वास्तव में, एक ताजा अध्ययन में बड़ी मात्रा में (> 20 एल) फिल्टर कारतूस 18 का उपयोग करते हुए तटीय समुद्री जल के नमूनों की छानने का पता चला है। इसके अलावा, वे व्यक्तिगत रूप से पैक कर रहे हैं और बाँझ, और प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह के लिए कई कदम फिल्टर आवास में किया जा सकता है, इस प्रकार प्रयोगशाला 19 से संक्रमण की संभावना को कम करने। बाद वालासुविधा एडना metabarcoding के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें प्रदूषण का खतरा बना रहता है के बीच सबसे बड़ा प्रयोगात्मक को चुनौती दी 20,21। फिल्टर कारतूस के इन तकनीकी फायदे के बावजूद, यह दो अपवाद 8,15 साथ मछलियों की एडना अध्ययन में इस्तेमाल नहीं किया गया है।
यहाँ हम आवास खोलने में कटौती करने के लिए बिना अपने फिल्टर से फिल्टर कारतूस और एडना की निकासी के साथ पानी के नमूनों की छानने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम यह भी दो वैकल्पिक पानी छानने का काम पानी की मात्रा (≤4 एल या> 4 एल) के आधार पर सिस्टम प्रदान करते हैं। नव विकसित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन और एक पहले से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल हमारे शोध समूह 12,14,22,23 में एक ग्लास फाइबर फिल्टर का उपयोग करने की तुलना करने के लिए, हम एडना एक बड़ा मछलीघर टैंक से समुद्री जल का विश्लेषण metabarcoding प्रदर्शन (7,500 मीटर 3 ) ज्ञात प्रजातियों में रचना के साथ, और प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दो प्रोटोकॉल से निकाली गई पता चला प्रजातियों की संख्या दिखा। इस प्रोटोकॉल जके रूप में मछलियों से एडना metabarcoding के लिए विकसित किया गया है, लेकिन यह भी अन्य जीवों से एडना के लिए लागू है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कई metabarcoding जैसे पानी और मिट्टी के रूप में पर्यावरण के नमूनों का उपयोग अध्ययन में, फिल्टर कारतूस के बाद निस्पंदन उपचार आम तौर पर इस प्रकार है 24,25: 1) खुला काटने या हाथ उपकरण (ट्यूबिंग कटर या सरौता) के साथ आव?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
Referências
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
