एक अनूठा चूहा जिगर hilar क्लैंप मॉडल ischemia-reperfusion चोट सुधारने में pharmacologic अणुओं के प्रभाव के अध्ययन के लिए विकसित किया गया था। यह मॉडल प्रत्यक्ष यकृत प्रसव के लिए अनुमति देता है, पोर्टल शिरा की एक शाखा के माध्यम से इस्कीमिक जिगर खंड के लिए पोर्टल की आपूर्ति के प्रत्यक्ष केन्युलेशन भी शामिल है।
प्रवाह रोड़ा, और यकृत प्रत्यारोपण के साथ मेजर यकृत सर्जरी, गर्म ischemia की अवधि, और ischemia / reperfusion (आई / आर) असंख्य नकारात्मक परिणामों के साथ चोट करने के लिए अग्रणी reperfusion की अवधि आवश्यकता होती है। यकृत प्रत्यारोपण के लिए किस्मत में सीमांत अंगों में संभावित मैं / आर चोट वर्तमान दाता कमी एक कम अंग उपयोग दर करने के लिए माध्यमिक योगदान देता है। एक महत्वपूर्ण जरूरत आदेश प्रत्यारोपण में भ्रष्टाचार समारोह पर इसके प्रभाव मध्यस्थता करने में यकृत मैं / आर चोट का पता लगाने के लिए मौजूद है। चूहा जिगर hilar क्लैंप मॉडल यकृत मैं / आर चोट पर विभिन्न अणुओं के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जाता है। मॉडल के आधार पर, इन अणुओं परिधीय बेहतर mesenteric नस में साँस लेना, एपीड्यूरल अर्क, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन, नसों में प्रशासन या इंजेक्शन का उपयोग कर वितरित किया गया। एक चूहा जिगर hilar क्लैंप मॉडल मैं / आर चोट सुधारने में pharmacologic अणुओं के प्रभाव का अध्ययन करने में उपयोग के लिए विकसित किया गया है। describचूहा जिगर hilar क्लैंप के लिए एड मॉडल प्रत्यक्ष कमानी यकृत प्रसव के लिए अनुमति देता है, पोर्टल शिरा का एक पक्ष शाखा के माध्यम से इस्कीमिक यकृत खंड के लिए पोर्टल की आपूर्ति के प्रत्यक्ष केन्युलेशन भी शामिल है। हमारा दृष्टिकोण 60 मिनट, जो समय के दौरान अध्ययन के तहत पदार्थ संचार कर रहा है के लिए छोड़ दिया पार्श्व और मंझला पालियों में ischemia प्रेरित करने के लिए है। इस मामले में, पेगीलेटेड-सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस (पीईजी-एस ओ डी), एक मुक्त कणों मेहतर, सीधे इस्कीमिक खंड में संचार कर रहा है। प्रयोगों की इस श्रृंखला को दर्शाता है कि पेग-एस ओ डी के अर्क यकृत मैं / आर चोट के खिलाफ रक्षात्मक है। इस दृष्टिकोण के लाभ वितरण और प्रणालीगत दुष्प्रभाव में कमी की मात्रा में कमी के साथ फलस्वरूप इस्कीमिक खंड में अणु के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल हैं।
प्रवाह रोड़ा, और यकृत प्रत्यारोपण के साथ मेजर यकृत सर्जरी, गर्म ischemia की अवधि, और ischemia / reperfusion (आई / आर) चोट 1 के लिए अग्रणी reperfusion की अवधि आवश्यकता होती है। जिगर में मैं / आर चोट के परिणामों बड़े पैमाने पर 1, 2, 3 विस्तृत किया गया है। मैं के परिणाम / आर चोट साहित्य में दिए गए विवरण में शामिल हैं: प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी, न्यूट्रोफिल की सक्रियता, Kupffer कोशिकाओं, और अंतर्कलीय कोशिकाओं, टोल की तरह रिसेप्टर्स की हीम oxygenase प्रणाली के सक्रियण और सक्रियण, एक सहित भड़काऊ झरना की दीक्षा endothelin और नाइट्रिक ऑक्साइड, परमाणु कारक-κB की सक्रियता, और proinflammatory cytokine और आसंजन अणु संश्लेषण 1, 2, 3 को बढ़ावा देने के बीच असंतुलन। ये समर्थक भड़काऊ घटनाओं एल मईapoptosis, परिगलन, अंग में शिथिलता और अंतिम अंग विफलता से 3 ead।
मैं / जिगर प्रत्यारोपण के लिए किस्मत में अंगों में आर चोट जल्दी भ्रष्टाचार हानि हो और मौजूदा दाता कमी के लिए योगदान के रूप में सीमांत अंगों चोट 3 लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कर सकते हैं। वर्तमान में 15,226 संयुक्त राज्य अमेरिका 4 में जिगर प्रत्यारोपण के लिए प्रतीक्षा सूची पर संभावित प्राप्तकर्ताओं और केवल 5,950 यकृत प्रत्यारोपण 2015 5 में प्रदर्शन किया गया हैं। अंग उपलब्धता में इस चरम सीमा के कारण, अनुसंधान की खोज यकृत मैं / आर चोट आदेश भ्रष्टाचार समारोह और अंग का सदुपयोग करने के लिए की जरूरत है।
पशु यकृत मैं / आर चोट अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया मॉडल चूहे hilar क्लैंप मॉडल और चूहा जिगर प्रत्यारोपण मॉडल शामिल हैं। वहाँ वर्तमान में उपयोग में चूहे hilar क्लैंप मॉडल की एक किस्म है। सबसे आम है, जिसमें से एक है पोर्टल शिरा, यकृत धमनी और पित्त डुसीटी की आपूर्ति बाईं पार्श्व और मंझला पालियों microsurgical क्लिप 6, 7, 8, 9, 10, 11, 60 मिनट से reperfusion की 30 से 60 मिनट के 6, 7, 10, 13, 14, और उसके बाद करने के लिए अवधि के लिए 12 का उपयोग कर क्लैम्प किया जाता है करने के लिए 24 घंटे 7, 9, 10, 13, 14 अनुमति दी है। चूहा जिगर के बाएँ पार्श्व और मंझला पालियों यकृत पैरेन्काइमा 9 का लगभग 70% शामिल हैं। इस्कीमिक शर्त अध्ययन करने के लिए तैयार किया गया है कुछ प्रोटोकॉल hilar वाहिकाओं के रुक-रुक कर clamping शामिलया हिंद-अंग ischemia की एक लंबी अवधि hilar वाहिकाओं 9, 13 क्लैम्पिंग द्वारा प्रेरित करने से पहले। वहाँ भी कई साहित्य में वर्णित संशोधनों कर रहे हैं। पहले क्लैंप को पोर्टल शिरा और यकृत धमनी छोड़ दिया पार्श्व और मंझला पालियों की आपूर्ति, लेकिन पित्त नली 15 को बाहर है। एक दूसरा संशोधन उनके विभाजन 16, 17, 18, 19, 20 से पहले पोर्टल शिरा, यकृत धमनी और पित्त नली क्लैम्पिंग द्वारा कुल यकृत ischemia प्रेरित करने के लिए है। एक तीसरा संशोधन 30 से 60 मिनट के लिए 8 दाएं पालि तक hilar वाहिकाओं के clamping भी शामिल है। एक अतिरिक्त संशोधन के क्रम में एक हिंद अंग में संवहनी बंडल क्लैम्पिंग जिगर 13, 21 में चोट प्रेरित करने के लिए शामिल है </sup>। Hilar क्लैंप प्रक्रिया के विभिन्न दृष्टिकोणों चित्रा 1 ए डी दर्शाए गए हैं।
चूहा जिगर hilar क्लैंप मॉडल यकृत मैं / आर पर विभिन्न अणुओं और यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। मॉडल के आधार पर इस्तेमाल किया इन अणुओं परिधीय बेहतर mesenteric नस 8 में साँस लेना 11, एपीड्यूरल अर्क 12, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 17, 18, 21, 22, नसों में प्रशासन 10, 14, 15, 19, 23, 24 या इंजेक्शन का उपयोग कर वितरित किया गया ।
चूहा जिगर hilar क्लैंप के लिए मॉडल इस रिपोर्ट में दिए गए विवरण समेतपोर्टल शिरा का एक पक्ष शाखा के माध्यम से इस्कीमिक खंड के लिए पोर्टल की आपूर्ति (चित्रा 2) है, जो अध्ययन के तहत औषधीय पदार्थ के प्रत्यक्ष कमानी यकृत प्रसव के लिए अनुमति देता है के प्रत्यक्ष केन्युलेशन es। हमारा दृष्टिकोण जो समय के दौरान अध्ययन के तहत पदार्थ के अर्क, इस मामले में, पेगीलेटेड-सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस, एक मुक्त कणों मेहतर 25, इस्कीमिक सेगमेंट में सीधे संचार किया जाता है, 60 मिनट के लिए छोड़ दिया पार्श्व और मंझला पालियों में ischemia प्रेरित करने के लिए है । रक्त के नमूने ischemia के शामिल होने से पहले और 120 मिनट के बाद reperfusion में लिया जाता है। इस बिंदु पर, चूहे बलिदान है और नमूने छोड़ दिया और मंझला पालियों से लिया जाता है। साथ ही, नमूने एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए सही पालि से लिया जाता है।
इस दृष्टिकोण के लिए कई लाभ हैं। सबसे पहले, मात्रा ओ जब अध्ययन के तहत pharmacologic पदार्थ सीधे इस्कीमिक खंड में इंजेक्ट किया जा सकता हैच वितरण प्रणालीगत संचलन में इंजेक्शन के वितरण की मात्रा या पेरिटोनियल गुहा की तुलना में काफी कम है। साथ ही, इस दृष्टिकोण को कम कर देता है, हालांकि समाप्त नहीं करती है, प्रणालीगत दुष्प्रभाव की संभावना।
प्रयोगों की इस श्रृंखला प्रदर्शन किया है कि बाईं में पेग-एस ओ डी और मंझला पालियों एएलटी की रिहाई में महत्वपूर्ण कम हो जाती है के लिए नेतृत्व किया, कोशिका झिल्ली के लिपिड peroxidation (एमडीए), और (GSH) ग्लूटेथिओन के रखरखाव के इंजेक्शन जब नियंत्रण के साथ तुलना में (सामान्य नमकीन )। Alanine aminotransferase (एएलटी) सहित जिगर ऊतक ट्रांसएमिनेस हेपैटोसेलुलर चोट के मार्करों स्थापित कर रहे हैं। एएलटी में कमी जब छोड़ दिया पालि पेग-एस ओ डी के साथ इंजेक्ट किया जाता है पेग-एस ओ डी के एक सुरक्षात्मक प्रभाव पता चलता है। बढ़ी हुई ऊतक एमडीए लिपिड peroxidation वृद्धि हुई इंगित करता है और oxidative तनाव और ऊतक चोट की एक मार्कर माना जाता है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के अधिक एमडीए 26 के उत्पादन में वृद्धि होती है। जानवर की बाईं और मंझला पालियों में ऊतक एमडीए में काफी कमी जब पेग-एस ओ डी इंजेक्शन पेग-एस ओ डी के एक सुरक्षात्मक प्रभाव को दर्शाता है। यह वर्तमान समझ है कि पेग-एस ओ नुकसान से कोशिकाओं की रक्षा के साथ संगत हैआंशिक रूप से कम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 27 की वजह से। साथ ही, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की उपस्थिति में, ग्लूटेथिओन डाइसल्फ़ाइड ग्लूटेथिओन (GSH) 28 के लिए कम है। जिगर आगे पेग-एस ओ डी इंजेक्शन के बाईं और मंझला पालियों में GSH में रखरखाव पेग-एस ओ डी के सुरक्षात्मक प्रभाव पुष्ट। इसके अतिरिक्त यह दिखा दिया है कि वहाँ cleaved कस्पासे -3, apoptosis के एक उत्पाद की वृद्धि हुई है ischemia-reperfusion चोट के संपर्क में ऊतकों में,। बाईं पालि जब पेग-एस ओ डी के साथ इलाज में cleaved कस्पासे -3 में कमी पता चलता है कि पेग-एस ओ डी apoptosis में कमी हो जाती है।
सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस (एस ओ डी) प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की विषहीन में एक महत्वपूर्ण एंजाइम है। एंजाइम हाइड्रोजन पेरोक्साइड और पानी में दो सुपरऑक्साइड anions का रूपांतरण catalyzes। एंजाइम केटालेज़ तो, पानी और ऑक्सीजन को हाइड्रोजन पेरोक्साइड धर्मान्तरित प्रक्रिया 25 को पूरा करने। का आधा जीवनदेशी एसओडी संयुग्मित polyethylene glycol-सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस (पीईजी-एस ओ डी) के विकास जब तक प्रयोगात्मक मॉडल में इसके उपयोग सीमित कर दिया। polyethylene glycol के लिए एस ओ डी के संयुग्मन 14 घंटे के लिए 6 मिनट से इसका अर्द्ध जीवन काल बढ़ जाती है। गुयेन एट अल। एक चूहे मॉडल में यकृत ischemia में लिपिड peroxidation कम करने के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन किया, प्रणालीगत वितरण 29 का उपयोग कर।
वहाँ तकनीक यहाँ विस्तृत और कुछ पहले से साहित्य में वर्णित किया गया है के संभावित संशोधनों की एक किस्म है। अणुओं मॉडल का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है साँस लेना 11, एपीड्यूरल अर्क 12, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 17, 18, 21, 22, नसों में प्रशासन 10, 14, 15 का उपयोग कर वितरित किया गया <sup>, 19, 23, 24 या इंजेक्शन परिधीय बेहतर mesenteric नस 8 में।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे महत्वपूर्ण पोर्टल शिरा के cannulation है। ध्यान रखा जाना चाहिए कि छेद नस में कटौती बहुत बड़ी नहीं है। ऊतक बहुत लोचदार है और छेद अपने आप ही विस्तार होगा। हम एक छेद microsurgical कैंची के साथ 0.5 मिमी है कि कटौती करके शुरुआत करें। प्रवेशनी एक साधन है, जो हाथ से प्रक्रिया के इस हिस्से को प्रदर्शन करने के लिए कोशिश कर रहा से अगर अधिक से अधिक चपलता के लिए अनुमति देता है का उपयोग करते हुए छेद के माध्यम से खिलाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, जबकि शुरू में प्रवेशनी खिला, यह सीधे छोड़ दिया और सही पोर्टल नसों के विभाजन की ओर नस के पीछे की दीवार के माध्यम से एक छेद poking से बचने के लिए उद्देश्य से किया जाना चाहिए। प्रवेशनी टिप विभाजन तक पहुँच जाता है, यह तो विशिष्ट बाईं नस में खिलाया जा सकता हैसहयोगी। एक बार जब प्रवेशनी बाईं पोर्टल शिरा, जो दोनों को छोड़ दिया और मंझला पालियों की आपूर्ति में खिलाया जाता है, अपनी स्थिति को नस के अंदर यह महसूस करके स्वयं भी पुष्टि की जा सकती। इसकी स्थिति भी ठंड खारा की एक छोटी राशि इंजेक्शन लगाने और जिगर की आपूर्ति क्षेत्रों पर blanching प्रभाव को देखने के द्वारा पुष्टि की जा सकती है।
चूहे में जिगर hilar क्लैंप मॉडल यकृत इस्कीमिक-reperfusion चोट प्रदर्शन करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और स्थिर मंच प्रदान करता है। चर hilar क्लैंप मॉडल शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है विरोधी oxidants और अन्य छोटे अणुओं 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 के सुरक्षात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के। भिन्नता के अंक में शामिल हैं जो जहाजों क्लैंप हैं एड, जो खंड इस्कीमिक बना रहे हैं या नहीं, पित्त नली शामिल किया गया है और reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 की अवधि की लंबाई, 19, 20, 21। इसके अतिरिक्त, जब इस मॉडल एक अणु प्रशासन का मार्ग के प्रशासन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है यह भी विषम है 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24। वहाँ वर्णित दृष्टिकोण के लिए कई फायदे हैं। सबसे पहले, इस्कीमिक खंड के लिए पोर्टल की आपूर्ति के प्रत्यक्ष केन्युलेशन के प्रत्यक्ष कमानी यकृत प्रसव के लिए अनुमति देता है अध्ययन के तहत औषधीय पदार्थ। यह एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में जिगर के अन्य खण्डों के उपयोग की अनुमति देता है। दूसरा, कमानी यकृत केन्युलेशन अणु के लिए वितरण की एक कम मात्रा अध्ययन किया जा रहा के लिए अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण जिससे प्रणालीगत दुष्प्रभाव के खतरे को कम पदार्थ हित के जिगर सेगमेंट में सीधे इंजेक्ट किया जाता है। यकृत खंड के प्रत्यक्ष केन्युलेशन वितरित किए जाने वाले पूर्व ischemia पदार्थ के लिए अनुमति देता है, इंट्रा-ischemia या बाद ischemia। यह ischemia-reperfusion चोट चक्र में किसी भी बिंदु पर अणु के प्रभाव के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इस्कीमिक समय की वृद्धि की लंबाई और जिगर उत्थान अध्ययन करने के लिए उपलब्ध होगा चोट अतिरिक्त अवसर के बढ़े हुए स्तर के साथ।
वहाँ भी इस दृष्टिकोण का कुछ सीमाएं हैं। पहले शुरू हुआ लागत है। एक शल्य माइक्रोस्कोप की खरीद एक प्रयोगशाला है कि पहले से ही एक अधिकारी नहीं है के लिए एक महत्वपूर्ण स्टार्ट-अप लागत हो सकता है। इस तकनीक को मुश्किल या असंभव एक खुर्दबीन के बिना हो सकता है। दूसरी अवस्था समय सीख रहा है। हालांकि इस प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल है, यह कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है और यह संभावना है कि एक नौसिखिया प्रक्रियाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या की आवश्यकता होती है एक विशेषज्ञ बनने के लिए होगा।
संक्षेप में, इस मॉडल यकृत ischemia-reperfusion चोट अध्ययन करने के लिए एक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सरल है, और लागत प्रभावी मंच के लिए अनुमति देता है। हालांकि प्रोटोकॉल में यहाँ polyethylene जीएल वर्णितycol-सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस, एक मुक्त कणों मेहतर 25, संचार किया गया था, इस मॉडल आदेश जिगर में मैं / आर चोट पर उनके प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अलग अलग pharmacologic पदार्थों की एक किस्म डालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने काम के लिए उदाहरण डेनिस मैथियास स्वीकार करने के लिए करना चाहते हैं। इस काम एनआईएच T32AI 106704-01A1 और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में अंग प्रत्यारोपण, छिड़काव, इंजीनियरिंग और उत्थान के लिए टी फ़्लेश कोष द्वारा समर्थित किया गया।
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |