מודל מהדק hilar כבד עכברוש ייחודי שפותח עבור הבוחנים את שפעת מולקולות תרופתיות לטיוב פגיע reperfusion-איסכמיה. מודל זה כולל cannulation ישיר של אספקת הפורטל למגזר הכבד איסכמי באמצעות סניף של וריד השער, המאפשר למסירה כבדה ישירה.
ניתוח בכבד סרן עם חסימת זרימה, השתלה כבדה, להצריך תקופה של איסכמיה החמה, ותקופה של reperfusion המוביל איסכמיה / reperfusion (I / R) פציעה עם השלכות שליליות עצומות. פציעת I / R פוטנציאל באיברים שוליים המיועד להשתלת כבד תורם המחסור התורם הנוכחי משתיים לשיעור ניצול איבר ירד. צורך משמעותי קיים לחקור שאני בכבד / פציעה R כדי לתווך והשפעתו על תפקוד שתל בהשתלות. כבד עכברוש דגמי מהדק hilar משמשים כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות שונות על פציעת I / R בכבד. בהתאם לדגם, מולקולות אלה הועברו באמצעות אינהלציה, עירוי אפידורל, הזרקת intraperitoneal, עירוי לוריד או הזרקה לווריד mesenteric מעולה הפריפריה. מודל מהדק עכברוש כבד hilar פותח לשימוש לומד את ההשפעה של מולקולות תרופתיות לטיוב פציעת I / R. describדגם ed עבור מהדק hilar עכברוש הכבד כולל cannulation ישיר של אספקת הפורטל למגזר הכבד איסכמי באמצעות סניף צד של וריד השער, המאפשר למסירת כבד מגזרית ישירה. הגישה שלנו היא לגרום איסכמיה באונות לרוחב ו חציון שמאל 60 דקות, במהלכן החומר נחקר הוא חדיר. במקרה זה, סופראוקסיד דיסמוטאז-PEGylated (PEG-SOD), נבלות רדיקלים חופשיים, הוא החדיר ישירות בקטע איסכמי. סדרת ניסויים זו ממחישה כי עירוי של PEG-SOD הוא מגן מפני פגיעה I / R בכבד. יתרונות של גישה זו כוללים הזרקה ישירה של המולקולה לתוך קטע איסכמי עם ירידה סוגרת נפח פיזור וצמצום תופעות לוואי מערכתיים.
ניתוח בכבד סרן עם חסימת הזרימה, השתלת כבד, להצריך תקופה של איסכמיה חמה, ותקופה של reperfusion המוביל איסכמיה / reperfusion (I / R) פציעה 1. ההשלכות של פגיעה I / R בכבד פורטו 1 בהרחבה, 2, 3. השלכות של I / פציעת R המפורטים בספרות כוללות: דור של מיני חמצן תגובתי, חניכה של המפל הדלקתי כולל הפעלה של נויטרופילים, תאי Kupffer, ותאי אנדותל, הפעלת מערכת oxygenase heme והפעלה של קולטנים דמוי אגרה, גידול חוסר איזון בין אנדותלין ו תחמוצת חנקתית, הפעלת גורם-κB גרעיני, וקידום של ציטוקינים מעודדי דלקת ו מולקולה הדבקה סינתזה 1, 2, 3. אירועים אלה עשויים מעודדי דלקת lהתפוצץ אפופטוזיס, נמק, תפקוד איברים כשל איברים הסופי 3.
I / R פגיע באיברים המיועדים להשתלת כבד יכול להוביל לאובדן שתל מוקדם תורם המחסור התורם הנוכחי כמו איברים שוליים רגישים יותר לפגיעה 3. ישנם כיום 15,226 נמענים פוטנציאליים ברשימת ההמתנה להשתלת כבד בארצות הברית 4 ורק 5950 השתלות כבד בוצעו ב 2015 5. בשל מגבלה קיצונית זו זמינה איבר, מחקר לחקור פציעת I / R כבד נחוצה על מנת לייעל פונקצית שוחד ניצול איברים.
מודלים בבעלי חיים המשמשים ללמוד פציעת I / R כבד כוללים מודלי מהדק hilar עכברוש ומודלי השתלת חולדה כבדות. יש מגוון של מודלים מהדק עכברוש hilar כיום בשימוש. הנפוץ ביותר הוא אחד שבו הוריד הפורטלי, עורק הכבד והמרה duct לספק את האונות לרוחב ו חציון שמאל הם הדקו באמצעות קטעי מייקרו 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 30 עד 60 דק '6, 7, 10, 13, 14, ולאחר מכן תקופה של reperfusion מ 60 דק' 7 כדי 24 שעות, 9, 10, 13, 14 מותר. האונות לרוחב ו החציוני השמאלי של הכבד עכברוש מהווים כ 70% של parenchyma הכבד 9. פרוטוקולים מסוימים שנועדו ללמוד נפשי מראש איסכמי כוללים הידוק לסירוגין של כלי hilarאו לפני-הגפיים האחוריים כדי לתקופה ארוכה של איסכמיה הנגרמת על ידי כיווץ כלי hilar 9, 13. ישנם גם מספר שינויים המתוארים בספרות. הראשון הוא מהדק הוריד הפורטלי ו עורק הכבד לספק את האונות לרוחב ו חציון שמאל, אבל להוציא את צינור המרה 15. שינוי שני הוא לגרום איסכמיה כבד הכולל על ידי כיווץ וריד הפורטלי, עורק כבד והמרת הצינור לפני חלוקתם 16, 17, 18, 19, 20. שינוי שלישי כולל הידוק של כלי hilar אל האונה הימנית במשך 30 עד 60 דקות 8. שינוי של תוספת כרוכה מהדק את הצרור וסקולרית איבר אחד אחורי כדי לגרום לפגיעה בכבד 13, 21 </sup>. גישות שונות כדי ההליך מהדק hilar הם באיור 1A-D.
עכברוש הכבד שימשו מודלים מהדק hilar ללמוד את ההשפעה של מולקולות ותרכובות שונות על שאני בכבד / R. בהתאם המודל המשמשים מולקולות אלה הועברו באמצעות אינהלציה 11, עירוי אפידורל 12, הזרקת intraperitoneal 17, 18, 21, 22, עירוי לוריד 10, 14, 15, 19, 23, 24 או הזרקה לוריד mesenteric המעולה ההיקפי 8 .
המודל עבור מהדק hilar כבד עכברוש המפורט includ דוח זהes cannulation הישירה של אספקת הפורטל למגזר איסכמי באמצעות סניף צד של וריד השער (איור 2), אשר מאפשרת למסירת כבד מגזרית ישירה של החומר התרופתי נחקר. הגישה שלנו היא לגרום איסכמיה באונות לרוחב ו חציון שמאל 60 דקות, במהלכן עירוי של חומר תחת מחקר, במקרה זה, PEGylated-דיסמוטאז סופראוקסיד, נבלות רדיקלים חופשיים 25, הוא החדיר ישירות בקטע איסכמי . דגימות דם נלקחו לפני אינדוקציה של איסכמיה ובבית 120 דק-רה-פרפוזיה פוסט. בשלב זה, העכברוש הוא הקריב ודגימות לקוחים מתוך אונות שמאל החציוני. בנוסף, דגימות נלקחות מהאונה הימנית כדי לשמש בקרה פנימית.
ישנם יתרונות רבים לגישה זו. בראש ובראשונה, כאשר המהות התרופתית תחת מחקר ניתן להזריק ישירות בקטע איסכמי O את הנפחהפצת F היא נמוכה למדי בהשוואה להיקף ההפצה של הזרקה לתוך המחזור המערכתי או חלל הצפק. בנוסף, גישה זו מפחיתה, אם כי אינו מבטל, את האפשרות של תופעות לוואי מערכתיות.
סדרת ניסויים זו הוכיחה כי הזרקה של PEG-SOD לתוך שמאל האונות חציון הוביל לירידה משמעותית ברמת שחרורו של ALT, חמצון השומנים של קרום התא (מד"א), ותחזוקה של גלוטתיון (GSH) בהשוואה לקבוצת הביקורת (מלח רגיל ). הטרנסאמינזות כבד רקמות כולל אלאנין אמינוטרנספראז (ALT) מבוססים סמנים של פציעה hepatocellular. ירידת ALT כאשר האונה השמאלית מוזרקת עם PEG-SOD מצביעה על אפקט מגן של PEG-SOD. רקמה מוגברת מד"א מציין גדל חמצון שומנים ונחשב סמן של עקה חמצונית פגיעות ברקמות. ייצור יתר של מיני חמצן תגובתי גורם לעלייה בייצור של מד"א 26. הירידה המשמעותית ברקמת מד"א אונות שמאל החציוני של החיה כאשר מוזרקת עם PEG-SOD מדגימה השפעה מגנה של PEG-SOD. זה עולה בקנה אחד עם ההבנה הנוכחית כי PEG-SOD ומגן על התאים מפני נזקנגרם על ידי מיני חמצן תגובתי קטינה באופן חלקי 27. בנוסף, בנוכחות של מינים חמצן תגובתי, דיסולפיד גלוטתיון מצטמצם גלוטתיון (GSH) 28. התחזוקה ב GSH באונות שמאל החציוני של הכבד מוזרק עם PEG-SOD מחזקת את אפקט מגן של PEG-SOD. בנוסף יוכח כי יש עליית caspase-3 בקע, תוצר של אפופטוזיס, ברקמת חשופים לפגיעת איסכמיה-רה-פרפוזיה. הירידה caspase-3 ביקע באונה השמאלית כאשר טופלו PEG-SOD עולה כי PEG-SOD מוביל לירידה אפופטוזיס.
סופראוקסיד Superoxide (SOD) הוא אנזים קריטי הרעלים של מיני חמצן תגובתי. האנזים מזרז את ההמרה של שני אניוני דיסמוטאז לתוך מי חמצן ומים. האנזים catalase אז ממיר מי חמצן למים וחמצן, השלים התהליך 25. זמן מחצית החיים שלSOD ילידי מוגבל השימוש בו דגמים ניסיוניים עד לפיתוח של סופראוקסיד דיסמוטאז גליקול-פוליאתילן מצומדות (PEG-SOD). נטייה של SOD כדי פוליאתילן גליקול מגבירה מחצית החיים שלו מ 6 דקות כדי 14 h. נגוין ואח '. הפגן יכולתה להקטין חמצון שומנים ב איסכמיה הכבד במודל חולדה, באמצעות משלוח מערכתי 29.
יש מגוון של שינויים פוטנציאליים של הטכניקה מפורטת כאן וכמה תוארו בעבר בספרות. בהתאם המולקולות לשמש המודל הועבר באמצעות אינהלציה 11, עירוי אפידורל 12, הזרקת intraperitoneal 17, 18, 21, 22, עירוי לוריד 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 או הזרקה לוריד mesenteric המעולה ההיקפי 8.
ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. החשוב ביותר הוא cannulation של וריד השער. יש להקפיד כי החור לחתוך בווריד אינו גדול מדי. הרקמה מאוד אלסטי והחור יגדיל בכוחות עצמה. מומלץ להתחיל על ידי חיתוך חור כי הוא 0.5 מ"מ עם מספריים מיקרו. הצינורית יכולה להיות מוזנת דרך החור באמצעות מכשיר, המאפשר גמישות רבה יותר מאשר אם מנסה לבצע חלק זה של ההליך ביד. בנוסף, בעוד בתחילה האכלת הצינורית, זה צריך להיות מכוון ישירות אל ההסתעפות של ורידי פורטל ימינה ושמאלה כדי למנוע תקיעת חור בקיר האחורי של הווריד. כאשר קצה הצינורית מגיע ההסתעפות, זה אז יכול להיות מוזן לתוך וריד השמאל ספציפיברית. לאחר הצינורית מוזן לתוך וריד הפורטלי השמאלי, המספק ומשמאל אונות חציון, מעמדה ניתן לאשר באופן ידני על ידי מרגיש את זה בתוך הווריד. המיקום שלו יכול גם להיות מאושר על ידי הזרקת כמות קטנה של מלח קר ולראות את ההשפעה הלבנה על המגזרים המסופקים של הכבד.
מודל מהדק הכבד hilar בחולדה מספק פלטפורמה לשחזור ויציבה עבור הוכחת פגיעה בכבד איסכמי-רה-פרפוזיה. מודלי מהדק hilar משתנים כבר בשימוש על ידי חוקרים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של אוקסידנטים אנטי ומולקולות קטנות אחרות 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. נקודות של וריאציה לכלול בה כלי הם מהדקים אד, אשר קטע מבוצעים איסכמי, או אם לא בצינור המרה נכלל ואת אורך תקופת reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. בנוסף, כאשר מודל זה משמש כדי ללמוד את ההשפעה של ממשל של מולקולת תוואי הממשל הוא גם הטרוגנית 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. ישנם מספר יתרונות הגישה המתוארת. ראשית, cannulation הישירה של אספקת הפורטל למגזר איסכמי מאפשרת למסירת כבד מגזרית ישירה של החומר התרופתי תחת מחקר. זה מאפשר ניצול של האונות השנייה של כבדי בקרה פנימית. שנית, cannulation כבד המגזרי מאפשר נפח פיזור מופחת עבור המולקולה הנלמדת. גישה זו ובכך מפחיתה את הסיכון של תופעות לוואי מערכתיות כמו החומר מוזרק ישירות בקטע הכבד של עניין. cannulation הישיר של המקטע הכבד מאפשר את החומר כדי להיות מועבר-איסכמיה מראש,-איסכמיה תוך או-איסכמיה פוסט. זה מאפשר לימוד של השפעת המולקולה בכל נקודה במחזור פציעת איסכמיה-רה-פרפוזיה. עם אורך מוגבר של זמן איסכמי ו רמה מוגברת של הזדמנות נוספת פציעה ללמוד התחדשות כבדה יהיה זמין.
ישנם גם מספר מגבלות של גישה זו. הראשון הוא עלות הזנק. הרכישה של מיקרוסקופ כירורגי יכול להיות עלות הזנק משמעותי עבור מעבדה שאינה כבר מחזיק אחד. טכניקה זו עשויה להיות קשה או בלתי אפשרית ללא מיקרוסקופ. השני הוא ללמוד זמן עקום. למרות הליך זה הוא יחסית פשוט זה דורש קצת תרגול וסביר להניח כי טירון ידרוש מספר משמעותי של הליכים להיות מומחה.
לסיכום, מודל זה מאפשר פלטפורמה לשחזור, פשוט, וחסכוני ללמוד פציעת reperfusion-איסכמיה כבדה. למרות בפרוטוקול המתואר כאן פוליאתילן GLסופראוקסיד דיסמוטאז ycol-, נבלות רדיקלים חופשיים 25, היה חדור, מודל זה יכול לשמש כדי להשרות מגוון של חומרים תרופתיים שונים על מנת להעריך את השפעתם על פציעה I / R בכבד.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות דניס מתיאס עבור עבודתו המחשה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32AI 106704-01A1 וקרן ט פלש להשתלת איברים, זלוף, הנדסה והתחדשות באוניברסיטת אוהיו.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |