وقد تم وضع فريد كبد الفئران نموذج المشبك نقيري لدراسة تأثير الجزيئات الدوائية في تخفيف إصابة نقص التروية ضخه. يتضمن هذا النموذج إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء الكبد الدماغية عن طريق أحد فروع الوريد البابي، والسماح للتسليم الكبدي المباشر.
جراحة الكبد الكبرى مع انسداد تدفق، وزراعة الكبد، تتطلب فترة من نقص التروية الدافئ، وفترة ضخه مما يؤدي إلى نقص التروية / ضخه (I / R) إصابة مع نتائج سلبية لا تعد ولا تحصى. المحتملة إصابة I / R في أجهزة هامشية المخصصة للزراعة الكبد تساهم في نقص المانحة الحالي الثانوي إلى معدل استخدام الجهاز انخفضت. وثمة حاجة كبيرة لاستكشاف الكبدية I / إصابة R من أجل التوسط تأثيرها على وظيفة الكسب غير المشروع في الزرع. وتستخدم كبد الفئران نماذج المشبك نقيري للتحقيق في تأثير جزيئات مختلفة على الكبد إصابة I / R. اعتمادا على النموذج، وقد تم تسليم هذه الجزيئات باستخدام استنشاق، ضخ فوق الجافية، حقن داخل الصفاق، الوريد أو الحقن في الوريد المحيطي المساريقي العلوي. وقد تم تطوير نموذج نقيري المشبك كبد الفئران لاستخدامها في دراسة تأثير الجزيئات الدوائية في تخفيف الإصابة I / R. وdescribإد نموذجا للالمشبك نقيري كبد الفئران يشمل إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء كبدي الدماغية عن طريق فرع جانب من الوريد البابي، والسماح لقطعي المباشر تسليم الكبدي. نهجنا هو للحث على نقص التروية في الفص الجانبي ومتوسط اليسرى لمدة 60 دقيقة، وخلال هذه الفترة هي التي غرست مادة قيد الدراسة. في هذه الحالة، pegylated-الفائق الفائق (PEG-SOD)، على القضاء على الجذور الحرة، هي التي غرست مباشرة إلى قطاع الدماغية. هذه السلسلة من التجارب تثبت أن ضخ PEG-SOD يقي الكبد إصابة I / R. وتشمل مزايا هذا النهج الحقن المباشر للجزيء في قطاع الدماغية مع ما يستتبع ذلك انخفاض في حجم التوزيع والحد من الآثار الجانبية الجهازية.
جراحة الكبد الكبرى مع انسداد تدفق، وزراعة الكبد، تتطلب فترة من نقص التروية الدافئ، وفترة ضخه مما يؤدي إلى نقص التروية / ضخه (I / R) إصابة 1. تم تفصيل عواقب الإصابة I / R في الكبد على نطاق واسع 1، 2، 3. عواقب I / R إصابة المفصل في الأدب وتشمل: جيل من أنواع الاكسجين التفاعلية، بدء من تتالي الالتهابات بما في ذلك تفعيل العدلات، وخلايا كوبفر، والخلايا البطانية، وتفعيل نظام الهيم أوكسيجيناز وتنشيط مستقبلات شبيهة عدد القتلى، ل اختلال التوازن بين endothelin وأكسيد النيتريك، وتفعيل النووية عامل كيلوبايت، وتعزيز خلوى الموالية للالتهابات والتوليف 1، 2، 3 جزيء التصاق. هذه الأحداث الموالية للالتهابات قد لEAD إلى موت الخلايا المبرمج، نخر، ضعف الجهاز وفشل الجهاز في نهاية المطاف 3.
I / R إصابة في الأجهزة المخصصة لزراعة الكبد يمكن أن يؤدي إلى فقدان الكسب غير المشروع في وقت مبكر، ويسهم في نقص المانحة الحالي كأجهزة هامشية أكثر عرضة للإصابة 3. يوجد حاليا 15226 المستفيدين المحتملين على قائمة الانتظار لزراعة الكبد في الولايات المتحدة (4) وفقط 5950 عملية زرع كبد أجريت في عام 2015 5. ونتيجة لهذا الحد الشديد في توافر الجهاز والبحوث استكشاف وهناك حاجة الكبدية إصابة I / R من أجل تحسين وظيفة الكسب غير المشروع واستغلال الجهاز.
نماذج حيوانية تستخدم لدراسة الكبد I / R إصابة تشمل الفئران نماذج نقيري المشبك ونماذج زرع كبد الفئران. وهناك مجموعة متنوعة من نماذج المشبك الفئران نقيري قيد الاستخدام حاليا. والأكثر شيوعا هو واحد الذي الوريد البابي، الشريان الكبدي والصفراء دوط توريد وفرضت الفصوص الجانبية والوسطية اليسرى باستخدام مقاطع المجهرية 6 و 7 و 8 و 9 و 10 و 11 و 12 لمدة 30 إلى 60 دقيقة 6 و 7 و 10 و 13 و 14، ثم فترة ضخه من 60 دقيقة ل24 ساعة 7، 9، 10، 13، 14 يسمح. تشمل الفصوص الجانبية والوسطية تبقى من كبد الفئران حوالي 70٪ من لحمة الكبد 9. وتشمل بعض البروتوكولات صممت لدراسة شروط مسبقة الدماغية لقط متقطعة من السفن نقيريأو الخلفية الأطراف الاصطناعية قبل فترة طويلة من نقص التروية الناجم عن تحامل على السفن نقيري 9 و 13. هناك أيضا العديد من التعديلات وصفها في المؤلفات. الأول هو لكبح الوريد البابي والشريان الكبدي توريد الفصوص الجانبية والوسطية اليسرى، ولكنها تستبعد القناة الصفراوية 15. والتعديل الثاني هو للحث على مجموع نقص تروية الكبد لقط الوريد البابي، الشريان الكبدي والقناة الصفراوية قبل انقسامها 16 و 17 و 18 و 19 و 20. ويشمل التعديل الثالث لقط الأوعية نقيري إلى الفص الأيمن لمدة 30 إلى 60 دقيقة 8. ينطوي على تعديل إضافي تحامل على حزمة الأوعية الدموية في الأطراف الخلفية واحدة من أجل حمل إصابة في الكبد 13 و 21 </suص>. موضحة الطرق المختلفة لإجراء المشبك نقيري في الشكل 1A-D.
وقد استخدمت كبد الفئران نماذج المشبك نقيري لدراسة تأثير الجزيئات والمركبات المختلفة على كبدي I / R. اعتمادا على نموذج مستخدمة قد تم تسليمها باستخدام استنشاق 11، ضخ فوق الجافية 12، حقن داخل الصفاق 17 و 18 و 21 و 22 و الوريد 10، 14، 15، 19، 23، 24 أو الحقن في الوريد المحيطي المساريقي العلوي 8 هذه الجزيئات .
نموذج للكبد الفئران نقيري المشبك بالتفصيل في هذا التقرير امبوفاق إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء الدماغية عن طريق فرع جانب من الوريد البابي (الشكل 2)، والذي يسمح للقطعي المباشر تسليم الكبد للمادة الدوائية تحت الدراسة. نهجنا هو للحث على نقص التروية في الفص الجانبي ومتوسط اليسرى لمدة 60 دقيقة، وهي الفترة التي وغرست ضخ مادة قيد الدراسة، في هذه الحالة، الفائق pegylated-الفائق، وهو جذري زبال الشحن 25، مباشرة في قطاع الدماغية . يتم أخذ عينات من الدم قبل تحريض نقص التروية وفي 120 دقيقة بعد ضخه. في هذه النقطة، يتم التضحية الفئران ويتم أخذ عينات من الفص الأيسر وسيطة. بالإضافة إلى ذلك، يتم أخذ عينات من الفص الأيمن لتكون بمثابة الرقابة الداخلية.
وهناك العديد من المزايا لهذا النهج. أولا وقبل كل شيء، عندما يكون مادة دوائية قيد الدراسة يمكن حقنه مباشرة في قطاع الدماغية حجم ستوزيع و منخفض جدا بالمقارنة مع حجم توزيع الحقن في الدورة الدموية أو التجويف البريتوني. بالإضافة إلى ذلك، يقلل هذا النهج، على الرغم من أن لا يلغي، وإمكانية الآثار الجانبية الجهازية.
أثبتت هذه السلسلة من التجارب التي حقن PEG-SOD إلى اليسار وفصوص متوسط أدى إلى انخفاض كبير في الإفراج عن ALT، بيروكسيد أغشية الخلايا (MDA)، وصيانة الجلوتاثيون (GSH) بالمقارنة مع الضوابط (المالحة عادي ). يتم تأسيس الترانساميناسات أنسجة الكبد بما في ذلك ألانين الألانين (ALT) علامات الإصابة الكبدية. انخفاض ALT عندما يتم حقن الفص الأيسر مع PEG-SOD يشير إلى وجود تأثير وقائي من PEG-الهيئة العامة للسدود. زيادة الأنسجة MDA يشير إلى زيادة بيروكسيد الدهون، ويعتبر علامة من الاكسدة وإصابة الأنسجة. الإفراط في أنواع الاكسجين التفاعلية يسبب زيادة في إنتاج MDA 26. الانخفاض الكبير في الأنسجة MDA في الفص الأيسر ومتوسط الحيوان عندما تم حقنها مع PEG-SOD يدل على تأثير وقائي من PEG-الهيئة العامة للسدود. وهذا يتفق مع الفهم الحالي أن PEG-الهيئة العامة للسدود تحمي الخلايا من التلفالناجمة عن انخفاض جزئيا أنواع الاكسجين التفاعلية (27). بالإضافة إلى ذلك، في وجود أنواع الاكسجين التفاعلية، يتم تقليل ثاني كبريتيد الجلوتاثيون لالجلوتاثيون (GSH) 28. صيانة في GSH في الفص الأيسر وسيطة من الكبد حقن PEG-الهيئة العامة للسدود أخرى تعزز تأثير وقائي من PEG-الهيئة العامة للسدود. بالإضافة إلى ذلك يتضح أن هناك زيادة كاسباس 3 المشقوق، وهو منتج من موت الخلايا المبرمج، في أنسجة معرضة للإصابة نقص التروية ضخه. انخفاض كاسباس 3 المشقوق في الفص الأيسر عندما تعامل مع PEG-SOD تشير إلى أن PEG-SOD يؤدي إلى انخفاض في موت الخلايا المبرمج.
الفائق (الاحمق) هو إنزيم حاسما في علاج الإدمان من أنواع الاكسجين التفاعلية. الإنزيم يحفز تحويل اثنين من الأنيونات دسموتاز في بيروكسيد الهيدروجين والماء. إنزيم الكاتلاز ثم تحويل بيروكسيد الهيدروجين في الماء والأكسجين، واستكمال عملية 25. نصف العمر للالهيئة العامة للسدود الأصلي يقتصر استخدامه في نماذج تجريبية حتى تطوير مترافق البولي ايثيلين جلايكول الفائق-الفائق (PEG-SOD). الإقتران من الهيئة العامة للسدود والبولي ايثيلين جلايكول يزيد على نصف العمر من 6 دقائق إلى 14 ساعة. نغوين وآخرون. أثبتت قدرتها على تخفيف الدهون بيروكسيد في نقص تروية الكبد في نموذج الفئران، وذلك باستخدام تسليم النظامية 29.
وهناك مجموعة متنوعة من التعديلات المحتملة للتقنية مفصلة هنا، وقد سبق وصفها البعض في الأدب. اعتمادا على نموذج استخدام جزيئات تم تسليمها باستخدام استنشاق 11، ضخ فوق الجافية 12، حقن داخل الصفاق 17 و 18 و 21 و 22 و الوريد 10، 14، 15 <suص>، 19، 23، 24 أو الحقن في الوريد المحيطي المتفوق المساريقي 8.
هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. والأكثر أهمية هو إقناء؛ إدخال القنية من الوريد البابي. ويجب الحرص على أن ثقب قطع في الوريد ليست كبيرة جدا. الأنسجة غير مرن جدا وسوف حفرة تكبير من تلقاء نفسها. نوصي بالبدء بقطع الحفرة التي هي 0.5 ملم مع مقص المجهرية. قنية يمكن تغذية من خلال ثقب باستخدام أداة، والذي يسمح لقدر أكبر من المرونة مما لو تحاول تنفيذ هذا الجزء من الإجراء باليد. بالإضافة إلى ذلك، في حين تغذية البداية قنية، ينبغي أن تهدف بصورة مباشرة إلى تشعب الأوردة بوابة اليسار واليمين لتجنب بدس ثقبا في الجدار الخلفي للالوريد. عندما يصل طرف قنية والتشعب، عندئذ يمكن إدخالها في الوريد الأيسر محددحليف. مرة واحدة ويتم تغذية قنية في الوريد البابي الأيسر، التي تمد كل من اليسار وفصوص متوسط، موقفها ويمكن التأكد يدويا عن طريق الشعور به داخل الوريد. ويمكن أيضا أن موقفها تأكيد عن طريق حقن كمية صغيرة من المياه المالحة الباردة ورؤية تأثير ابيضاض على الشرائح المعروضة من الكبد.
نموذج المشبك نقيري الكبد في الفئران يوفر منصة استنساخه ومستقرة لإثبات الكبد الإصابة الدماغية ضخه. وقد استخدمت متغير نماذج المشبك نقيري من قبل الباحثين لدراسة آثار وقائية من المواد المضادة للتأكسد وغيرها من جزيئات صغيرة 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14. وتشمل نقاط الاختلاف التي هي سفن المشبك الطبعه، والجزء الذي تتم الدماغية، سواء كان أو لم يتم تضمين القناة الصفراوية وطول فترة ضخه 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام هذا النموذج لدراسة تأثير إدارة جزيء مسار الإدارة هو أيضا غير متجانسة 8، 10، 11،"> 12، 14، 15، 17، 18، 19، 21، 22، 23، 24، وهناك العديد من المزايا لهذا النهج وصفها. أولا، إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء الدماغية يسمح قطعي تسليم الكبدي المباشر لل المادة الدوائية قيد الدراسة، وهذا يسمح الاستفادة من الفص الآخر من الكبد باعتبارها الرقابة الداخلية، وثانيا، إقناء؛ إدخال القنية الكبدي قطعي يسمح لانخفاض حجم التوزيع للجزيء التي تجري دراستها. هذا النهج وبالتالي يقلل من خطر الآثار الجانبية الجهازية كما يتم حقن مادة مباشرة في قطاع الكبد من الفائدة. إقناء؛ إدخال القنية المباشر للقطاع الكبدي يسمح للمادة أن يتم تسليمها قبل التروية، داخل نقص التروية أو بعد نقص التروية. وهذا يسمح لدراسة تأثير جزيء في أي نقطة في دورة إصابة نقص التروية ضخه. مع زيادة طول الوقت الدماغية وزيادة مستوى الإصابة فرصة إضافية لدراسة تجديد الكبد ستكون متاحة.
وهناك أيضا بعض القيود المفروضة على هذا النهج. الأول هو التكلفة بدء التشغيل. شراء الميكروسكوب الجراحي يمكن أن تكون تكلفة كبيرة لبدء لمختبر لا تملك بالفعل واحدة. قد يكون هذا الأسلوب من الصعب أو المستحيل بدون المجهر. والثاني هو التعلم الوقت منحنى. ورغم أن هذا الإجراء هو بسيط نسبيا كنه يتطلب بعض الممارسة وأنه من المرجح أن مبتدئ سوف تتطلب عددا كبيرا من الإجراءات ليصبح خبيرا.
باختصار، هذا النموذج يسمح لمنصة استنساخه وبسيطة، وفعالة من حيث التكلفة لدراسة الكبد إصابة نقص التروية ضخه. على الرغم من بروتوكول صفها هنا البولي ايثيلين GLycol-الفائق الفائق، وهو جذري زبال الشحن 25، وقد أكسب، وهذا النموذج يمكن أن تستخدم للبث مجموعة متنوعة من المواد الدوائية المختلفة من أجل تقييم تأثيرها على الإصابة I / R في الكبد.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نعترف دينيس ماتياس لعمله توضيحي. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة T32AI 106704-01A1 وصندوق T فليش لزراعة الأعضاء، الإرواء والهندسة والتجديد في جامعة ولاية أوهايو.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |