PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi
Summary
Burada, flow sitometri alerjen yüklü parçacıklar ölçmek için bir protokol mevcut. Ortam partiküler madde parçacıkları adsorbe alerjenlerin taşıyıcıları olarak hareket edebilir. Bu akış sitometrisi, bir yöntem olup çok çapı 0.5 um, bu alerjene yüklü parçacıkları ölçmek için kullanılabilir> askıda katı madde karakterize etmek için kullanılan burada gösterir.
Abstract
Akış sitometri yaygın olarak 0.5 ila çapı onlarca mikrometre büyüklüğünde bir boyut aralığında hücreleri ya da bakteri gibi askıda katı madde miktarını belirlemek için kullanılan bir yöntemdir. ileri ve yana saçılma özellikleri bir karakterizasyonu ek olarak, ilgili yapıların tespit etmek için antikorlar gibi flüoresan etiketli markerlerin kullanımı sağlar. dolaylı bir antikor lekelemesi kullanılarak, huş polen alerjeni ölçmek için sitometrisi Burada kullanıldığı akış solunabilir parçacık halinde madde (PM10, parçacık boyutu çapı ≤10 um) çapı 0.5 ila 10 um parçacıklar -yüklü (tam olarak v, 1 BET). adsorbe olan alerjenlerin taşıyıcısı muhtemelen onlar alerjik reaksiyonlara yol açabileceğini alt solunum yollarının, onları taşımak olarak PM10 partikülleri hareket edebilir.
Şimdiye kadar PM10 alerjen içeriği enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ve taramalı elektron mikroskobu ile incelenmiştir. ELISA parçacık çözündürüldü olup ölçerTT-bağlı allerjen. Alerjen yüklü parçacıklar görselleştirmek ayrıca onları ölçmek olabilir sitometrisi akabilir taramalı elektron mikroskobu ile karşılaştırıldığında. ortam havasının alerjen içeriği huş ağacı polen sayımı sapabilir gibi alerjik belirtiler belki polen sayımı daha alerjene maruz daha iyi korelasyon olabilir. klinik veriler ile birlikte, sunulan yöntem alerjik reaksiyonlar polen antijenleri PM10 partikülleri> 0.5 um Bet v 1 allerjen içeriği ile ilişkilidir huş edip gelecek deneylerde test etmek için bir fırsat sunmaktadır.
Introduction
Hava kirliliği son yıllarda 1-3 gözlenen solunum alerji artan insidansı ve şiddeti önemli bir çevre nedeni olarak kabul ediliyor. Ayrıca, toz 4,5'ten ortak allerjenlerin dağılımında giderek artan bir ilgi vardı.
Huş ağacı polen saman nezlesi sebep olabilir ama aynı zamanda alerjik astım 6-8 önemli bir tetikleyicisi olabilir. Tüm huş poleni alt solunum yoluna veya boyutu (çapı 22 mm) bir sonucu olarak, PM10 bulunabilir olası değildir. Ancak, Bet v 1, büyük huş poleni alerjen bileşeni gibi huş ağacı poleni alerjenler polen rüptürü 9 sonra serbest bırakılabilir ve alt solunum yollarını böylece muhtemelen, ortam hava partiküllerinin 10 bağlanan girebilirsiniz. Gerçekten de, bir polen alerjisi Probandın 11 bazofil in vitro aktivasyonu ile gösterildiği gibi PM10 biyolojik olarak aktif alerjenler içerebilir gösterilmiştir </sus>.
PM10 örneklerinde Bet v 1 allerjen içeriği ELISA 12-14 ile ilgili alerjen ve sonraki ölçümü ayıklanması tarafından incelenmiştir. ELISA tekniği ile, çözünmüş alerjen ölçüldü, ancak allerjen yüklü parçacıkların miktarı hala bilinmemektedir. Taramalı elektron mikroskobu alerjen yüklü parçacıklar açığa ama miktarının 10,15 izin vermedi.
Bu çalışma ortam havası örneklerinde Bet v 1-yüklü PM10 partikülleri oranını ölçmek için flow sitometri kullanır. akış saptama sınırının dolayı, sadece daha büyük 0,5 um incelenebilir parçacıkları sitometresi. PM10> 0.5 mikron fraksiyon PM10 olarak> 0.5 sevk edilecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
protokol kritik bir safha, çevredeki havadan PM10 partiküllerinin toplanması için uygun bir filtre kullanımı (adım 1.1). Filtre bir elektrik diş fırçası ile fırçalama katlanmak için yeterince güçlü olmak zorunda değil, tüm filtre malzemeleri bu şartı yerine getirmek. Boyama protokolü ml başına 8×10 6 parçacık, bir PM10 partikül konsantrasyonu ile kurulmuştur. materyal sınırlıdır ve numunelerin havuzu uygun değildir, ancak eğer yöntem muhtemelen de işlev görecektir, ancak antikor konsantrasyonları ayarlanması gerekebilir (adımlarını 3.5 ve 3.8 bakınız).
PM10 parçacıkların Bet v 1 boyama pozitif ve negatif boyanmış parçacıkların farklı popülasyonlarda sonuçlanmamıştır. Bu kadar çok az bir miktarda yüksek arasında değişen partiküller her adsorbe Bet v 1 alerjen değişen miktarlarda neden olabilir. Bu nedenle nüfus doğru kayması APC sinyali genişlemesine neden olabilirAPC pozitifliği. Tüm parçacıkların ortalama APC floresans yoğunluğunu ölçülmesi ile (I) 'e göre miktar: negatif parçacıklardan pozitif ayırmak zor olduğu için, iki belirleme yöntemi PM10> 0.5 örneklerin Bet v 1 içeriğine farklılıkları belirlemek için kullanıldı ve (ii) APC pozitif parçacıkların oranının belirlenmesini içerir. Düşük ve yüksek polen sezonu PM10> 0.5 parçacıkların Bet v 1 yükü ile ilgili olarak, her iki yöntem de benzer sonuçlar ortaya koydu. bu nedenle kapıyı yerleştirme bağımsız ve olduğu gibi Yine de, tüm parçacıkların ortalama floresan yoğunluğu göreceli ölçümü önerilmektedir muhtemelen daha az hata eğilimli.
Bugüne kadar birçok çalışma ELISA 5,12-14,17 ile ilgili alerjen ve sonraki ölçümü çıkartarak ortam hava partiküler madde alerjen içeriğini incelemek. Burada anlatılan prosedürü ve quantificatio arasında temel bir fark vardırn ELISA ile: akış sitometri parçacık bağlı antijen analizleri ise ELISA, ayıklanır ve çözünmüş antijeni rakamlarla. ELISA vasıtasıyla test PM10 örneklerin Bet v 1 yük (n = 8) 1.2 ng / ml teşhis sınırının altında olduğunu (veriler gösterilmemiştir). Benzer şekilde, Buters ve diğerleri PM <2.5 mikron fraksiyonu ve 10 um sadece yaklaşık% 7> PM> 2.5 mikron fraksiyonu, ancak PM ortam havasının 13> 10 mikron kesir fazla% 93 hiçbir Bahis v 1 belirledi. Bir taraftan ve diğer taraftan da, FACS analizi, ELISA zıt sonuçları, birbirinden farklı hassasiyet ile bağlantılı olarak saptama yöntemi farklılıklardan kaynaklanabilir. Daha fazla araştırma ancak tam olarak bu farkı anlamak için gereklidir.
Bir yöntem parçacık bağlı antijen elektron mikroskobu 10,14 tarıyor görselleştirmek için. Taramalı elektron mikroskopisi, Ormstad ve ark., Asılı partikül mat yüzeyi görsel Bet v 1r kurum parçacıkları yüksek polen mevsimi ve düşük polen sezon 15 örneklenmiş parçacıklar üzerinde daha az bir ölçüde örneklenmiş. Buna ek olarak, polen, lateks ve β-glukan alerjenleri, ortam havası 10 yanma parçacıklarına bulunmuştur. Bu yöntem, bununla birlikte, partikül bağlı allerjen miktarının izin vermez.
akış sitometrisi kullanılmasıyla parçacık bağlı Bet v 1 alerjen nicelendirilebilir. Böylece, yandan diğer uygun antikorlar gibi PM10 10 ile 0,5 um biyolojik fraksiyonu karakterize etmek için yeni bir yol sunabilir akış sitometri, bu yöntem, ortam hava partiküllerinin, örneğin, kalıp, toz akarı diğer antijenlerin tespiti için uzatılabilir olabilir alerjenler veya LPS. PM10 partikülleri oldukça kolay da kimyasallar ve metaller sadece biyolojik madde absorbe, ancak, antikorların bağlanma belirsiz, ancak bir sorun teşkil edebilir. Yeni bir antikor test edilirse, kritik bir adımdır belirli bağlama kanıtlamak içining. Bu 11 boyanmadan önce ilgili antijen ile spesifik antikor bağlanma kapasitesini bloke örneğin yapılabilir.
14,18 saymak Bet v olarak ortam havasının 1 içerik huş poleni sayısı 12,13,18 farklı olabilir, alerjik belirtiler belki polen ile daha alerjen düzeyi ile daha iyi ilişki olabilir. Bu nedenle, klinik verilerle birlikte sunulan yöntem huş alerjik reaksiyonlar PM10> 0.5 Bet v 1 alerjen yükü uygun olup olmadığını gelecek deneylerde incelemek için olanak sağlar.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.
Materials
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/h |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55mm, H 15mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1,4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
Referências
- Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?. J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
- Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
- Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
- Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
- Brough, H. A., et al. Distribution of peanut protein in the home environment. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).
- Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. The development of allergic inflammation. Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).
- World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. , 256 (2003).
- Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
- Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
- Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
- Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
- Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
- Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
- Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
- Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
- Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
- Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).
