Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll allergen-beladenen Partikel durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Feinstaub in der Luft Partikel können als Träger von adsorbiertem Allergene wirken. Wir zeigen hier, dass der Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zur Charakterisierung von Schwebstoffen verwendet> 0,5 um im Durchmesser, können diese allergen-beladenen Partikel zu messen, verwendet werden.
Abstract
Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zu quantifizieren Schwebstoffe wie Zellen oder Bakterien in einem Größenbereich von 0,5 bis einigen zehn Mikrometern im Durchmesser verwendet. Zusätzlich zu einer Charakterisierung von Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften ermöglicht es die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Markern wie Antikörpern jeweiligen Strukturen zu erkennen. Verwendung indirekten Antikörperfärbung, Durchflusszytometrie wird hier verwendet birch pollen allergen zu quantifizieren (genau Bet v 1) -beladene Teilchen von 0,5 bis 10 um im Durchmesser in inhalierbaren Partikeln (PM10, Teilchengröße ≤10 & mgr; m im Durchmesser). PM10 Partikel wirken können als Träger von adsorbierten Allergenen sie möglicherweise auf die unteren Atemwege zu transportieren, wo sie allergische Reaktionen auslösen können.
Bisher ist die Allergengehalt von PM10 wurde mittels enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) und Rasterelektronenmikroskopie untersucht. ELISA misst die gelöste und nicht die Partikel-bound Allergen. Im Vergleich zu der Rasterelektronenmikroskopie, die allergen-beladenen Partikel visualisieren kann, Cytometry fließen kann zusätzlich sie quantifizieren. Als Allergengehalt der Umgebungsluft aus Birkenpollen Zahl abweichen können, können allergische Symptome vielleicht besser korrelieren mit Allergenexposition als mit Pollenflug. In Verbindung mit den klinischen Daten, bietet die vorgestellte Methode die Möglichkeit, in zukünftigen Experimenten zu testen, ob allergische Reaktionen Pollenantigene gegen Birkenpollen mit dem Bet v 1 Allergen zugeordnet sind, Gehalt an PM10-Partikel> 0,5 um.
Introduction
Die Luftverschmutzung ist 1-3 in den letzten Jahrzehnten als wichtiger Umwelt Ursache für die erhöhte Häufigkeit und Schwere von Atemwegsallergien beobachtet werden berücksichtigt. Außerdem gab es bei der Verteilung von häufigen Allergenen in Staub 4,5 zunehmendes Interesse.
Birkenpollen kann Heuschnupfen auslösen kann aber auch ein wichtiger Auslöser von allergischem Asthma 6-8 sein. Whole Birkenpollen ist nicht wahrscheinlich die unteren Atemwege zu betreten oder in PM10 infolge seiner Größe (22 & mgr; m im Durchmesser) zu finden sind. Allerdings Birkenpollenallergenen wie Bet v 1, dem Hauptbirkenpollenallergen – Komponente können nach Pollen Bruch 9 freigesetzt werden und 10 bis Umgebungsluftpartikel binden kann, wodurch möglicherweise die unteren Atemwege gelangen. Tatsächlich hat es sich gezeigt , dass PM10 biologisch aktiven Allergenen durch in vitro Aktivierung von Basophilen von einem Pollen allergischen Probanden wie gezeigt , enthalten 11 </sup>.
Bet v 1 Allergengehalt in PM10 – Proben wurde durch Extraktion des jeweiligen Allergen und anschließende Quantifizierung mit ELISA 12-14 untersucht worden. Mit der ELISA-Technik wurde das gelöste Allergen gemessen, aber die Menge des allergenbeladenen Partikel blieben noch unbekannt. Rasterelektronenmikroskopische allergenbeladenen Partikel ergab , aber nicht erlauben die Quantifizierung 10,15.
Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie den Anteil der Bet v 1-beladenen Partikel in PM10 Umgebungsluftproben zu quantifizieren. Aufgrund der Nachweisgrenze des Durchflusszytometers nur Partikel größer als 0,5 & mgr; m untersucht werden. Die> 0,5 um Anteil an PM10 weiter als PM10> 0.5 bezeichnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Verwendung eines geeigneten Filters für die Sammlung von PM10 Partikel aus der Umgebungsluft (siehe Schritt 1.1). Der Filter muss stark genug sein, mit einer elektrischen Zahnbürste zu ertragen Bürsten, und nicht alle Filtermaterialien erfüllen diese Anforderung. Das Färbungsprotokoll wurde mit einer PM10 Partikelkonzentration von 8×10 6 Partikel pro ml hergestellt. Allerdings, wenn das Material begrenzt ist und die Bündelung von Proben nicht geeignet ist, wird das Verfahren wahrscheinlich genauso gut funktionieren, aber die Antikörper-Konzentrationen (siehe Schritte 3.5 und 3.8) können angepasst werden müssen.
Bet v 1-Färbung von PM10-Partikel ergab keine unterschiedlichen Populationen von positiv und negativ gefärbten Teilchen. Dies könnte durch die unterschiedlichen Mengen von Bet v 1 Allergens auf jede der von sehr kleinen bis zu einer hohen Menge im Bereich Partikel adsorbiert verursacht werden. Dies könnte in der Erweiterung des APC-Signal führen somit die Bevölkerung verschiebt sich in RichtungAPC-Positivität. Da es schwierig ist , den positiven von den negativen Teilchen zu trennen, wurden zwei Quantifizierungsmethoden verwendet , um die Unterschiede in der Bet v 1 – Gehalt der PM10> 0,5 Proben zu bestimmen: (i) eine relative Quantifizierung durch den Median APC Fluoreszenzintensität aller Teilchen Mess und (ii) Bestimmung des Prozentsatzes von APC positive Partikel. Die Bet v 1 – Last von Partikeln aus niedrigen und hohen Pollensaison PM10 In Bezug auf > 0,5 zeigten beide Methoden ähnliche Ergebnisse. Dennoch empfiehlt sich eine relative Quantifizierung durch mittlere Fluoreszenzintensität aller Partikel, wie es das Gate des Anordnens und daher wahrscheinlich weniger fehleranfällig unabhängig ist.
Viele Studien Bisher untersuchen die Allergengehalt in der Umgebungsluft Feinstaub durch das jeweilige Allergen und anschließende Quantifizierung Extraktion mit ELISA 5,12-14,17. Es besteht ein grundlegender Unterschied zwischen der hier beschriebene Verfahren und die quantification mit ELISA: ELISA quantifiziert die extrahiert und aufgelöst Antigen, während der Durchflusszytometrie die partikelgebundenen Antigen analysiert. Mittels ELISA die Bet v 1 Last der getesteten PM10 Proben (n = 8) unterhalb der Nachweisgrenze von 1,2 ng / ml (Daten nicht gezeigt). In ähnlicher Weise identifiziert Buters und andere keine Bet v 1 in der PM <2,5 & mgr; m – Fraktion und nur etwa 7% in der 10 & mgr; m> PM> 2,5 um – Fraktion, aber mehr als 93% in der PM> 10 um Anteil an Umgebungsluft 13. Die kontrastier Ergebnisse des ELISA auf der einen Seite und der FACS-Analyse auf der anderen Seite kann durch Unterschiede in der Detektionsverfahrens in Verbindung mit divergenten Empfindlichkeit verursacht werden. Weitere Forschung ist jedoch nötig, um diesen Unterschied zu verstehen.
Ein Verfahren zur Visualisierung partikelgebundene Antigen wird rasterelektronenmikroskopisch 10,14. Durch Rasterelektronenmikroskopie, Ormstad et al. Visualisierten Bet v 1 an der Oberfläche von suspendierten teilchenförmigen matter Rußpartikeln im Hochpollensaison abgetastet und in geringerem Maße von Partikeln im Niederpollensaison abgetastete 15. Zusätzlich Allergenen aus Pollen, Latex und auch β-Glucane wurden gefunden 10 bis Verbrennungspartikel in der Luft adsorbiert werden. Dieses Verfahren erlaubt jedoch nicht die Quantifizierung des partikelgebundenen Allergen.
Durch die Verwendung der Durchflusszytometrie, partikelgebundene Bet v 1 Allergen quantifiziert werden konnte. Somit Durchflusszytometrie eine neue Möglichkeit bieten kann , die von 10 bis 0,5 & mgr; m biologische Fraktion von PM10 als mit anderen geeigneten Antikörpern auf der Hand zu charakterisieren, kann dieses Verfahren auf die Detektion von anderen Antigenen über die Luftpartikel ausgedehnt werden, beispielsweise Schimmel, Hausstaubmilben Allergene oder LPS. Als PM10 Partikel nicht nur biologische Material adsorbieren, sondern auch Chemikalien und Metalle ganz leicht, unspezifische Bindung von Antikörpern könnte, stellen jedoch ein Problem. Wenn ein neuer Antikörper getestet wird, ist ein kritischer Schritt spezifischen bind beweisening. Dies kann dadurch erfolgen, um beispielsweise die Bindungskapazität des spezifischen Antikörpers mit dem entsprechenden Antigen Blockierung vor 11 bis Anfärbung.
Als Bet v 1 – Gehalt von Umgebungsluft aus Birkenpollen Zahl unterscheiden können 12,13,18, könnten allergische Symptome korrelieren vielleicht besser mit Allergengehalt als mit Pollen 14,18 zählen. Daher ermöglicht das vorgestellte Verfahren in Verbindung mit klinischen Daten in zukünftigen Experimenten zu untersuchen , ob allergische Reaktionen entsprechen dem Bet v 1 Allergenbelastung von PM10> 0,5 bis Birke.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.
Materials
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/h |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55mm, H 15mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1,4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
Referências
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