粒子结合Bet v 1的变应原PM10的流式细胞分析

注：本协议描述了单克隆抗体PM10颗粒对Bet v 1的，主要的桦树花粉抗原成分，再加上别藻蓝蛋白（APC）间接染色（单克隆小鼠IgG1抗体，克隆MA-3B4）标记的二次抗体（抗-mouse IgG1抗体，克隆A85-1）和流式细胞随后的分析。适当的其他抗体可用，此方法也可能延伸到检测结合到周围空气中的颗粒的其他抗原。 1. PM10采样从聚四氟乙烯（PTFE）的环境空气收集PM10滤波器使用低容量采样2.3 立方米 /小时（ 图1）的流量。用于这里所描述的实验中取样的表征在16中找到。运行时间取决于所需的可吸入颗粒物的量（通常为1至10天）。 在温育时间结束时，从采样移除过滤器，并在将其冻结-20℃下直到使用。 图1.低容积PM10采样器。一个低容积PM10采样的例子。 请点击此处查看该图的放大版本。 2.去除可吸入颗粒物和粒子计数让约5分钟的PTFE过滤解冻。然后，将过滤器在一个干净的聚苯乙烯培养皿（ 图2A）。取一个新的培养皿的每个滤波器中，如果一个以上的过滤器进行处理。 接着，覆盖用磷酸盐缓冲盐水（PBS）的PTFE过滤器。此协议，建立了每ml 8×10的6颗粒的最终PM10浓度（参见步骤3.3）。以获得至少该浓度，使用PBS中的下列经验体积与覆盖在过滤器：如果PM10收集时间为< 2天后，使用2个毫升对于孵育时间≥2天，采用4毫升注意：为了增加PM10悬浮液的粒子浓度，从不同的过滤器混悬液可被汇集，如果这是合适的。 握住镊子和刷PTFE过滤器与一个敏感刷头1分钟（ 图2B，2C）的电牙刷。传送颗粒的PBS悬浮，以后称为PM10混悬液，向一干净反应管。 图2. PM10除去有电牙刷与采样PM10聚四氟乙烯过滤器被放置在一个聚苯乙烯培养皿（A）和叠置用4ml PBS中。然后，PM10与一个电牙刷去除（A：刷牙1分钟后：刷牙和C之前）。=“http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。 测量PM10颗粒， 例如浓度，通过使用粒子计数器。稀PM10悬浮例如50微升在10ml等渗测量缓冲器的充足体积，测量三次，并计算每毫升微粒的平均总数。一定要使用它可以检测相关的大小颗粒的粒子计数器。 3. Bet v 1的染色计算样品的分析所需的反应管的数量：至少有三个需要反应管：（i）一种管只有样品（天然对照）（ii）一种管与样品加二级抗体（阴性对照），和（ iii）一名管品加一级和二级抗体（具体的样品）。如果是第一次测量，准备（i）至少两个反应管（ii）中，（三）有足够的材料来适当调整设置流式细胞仪（见步骤4.1）。 计算PM10悬浮于反应管的数量所需的量。每个反应管需要50微升悬浮液。 调整在步骤2.4悬浮液中加入PBS中适当量的在步骤3.2计算每毫升8×10的6颗粒的终浓度的量测得的粒子浓度。 注：其余PM10悬浮液可在-20℃用于以后的实验被冻结，尽管该协议新鲜建议制备PM10悬浮液。 块通过在0.02％的最终浓度，补充PM10悬浮液用牛血清白蛋白（BSA）使用的储备溶液用PBS制备如1％BSA的非特异性结合。短暂涡旋并孵育在室温下20分钟。 用于向通过流式细胞术来分析各样品，转移50微升悬浮液从步骤3.4到交流精益反应管中。添加抗Bet v 1的单克隆小鼠抗体以0.02微克/微升到指定用于特定染色，涡旋简要反应管的终浓度和孵育在室温下60分钟。 让与指定为本地控制和负控制也留在室温下60分钟的PM10-BSA悬浮反应管。 通过加入500微升的PBS补充有0.02％BSA的每个反应管中，涡旋短暂离心样品随后4700 xg离心在室温下5分钟洗净所有样本。通过使用真空泵小心弃上清。 重复步骤3.6。 确定APC标记的第二抗小鼠IgG1抗体的所需的总量：溶解在50μlPBS中补充有每反应管0.02％BSA的1微克抗体。稀释抗体的适当量与补充有0.02％BSA的PBS的各卷。 加入50μl稀释的第二抗体的所有反应管中，除了指定本地控制的反应管中。补充后者用50μl的PBS补充有0.02％牛血清白蛋白。涡旋所有样品几秒钟。 孵育所有样品在黑暗中30分钟。 重复步骤3.6的两倍。 加入50μl的PBS到每个反应管中，涡旋和流式细胞仪分析上的流动的样品。 4.流式细胞仪分析使用本机的控制，调整以下流式细胞仪参数来优化数据分析。 通过使用设备控制板上显示的前向散射（FSC）阈值控制，设置FSC阈值的最低值（200），并开始分析。 通过使用分散电压控制器，以这种方式调节FSC和侧向散射（SSC），所有的可吸入颗粒物的颗粒可以被检测和该颗粒群大致位于第在SSC轴的下半部分中的FSC轴以及e中间。 通过使用荧光电压控制器，调节APC电压和另一个荧光电压像异硫氰酸荧光素（FITC），它不象在APC同一波长，如有必要，不发出。确保，即所有的粒子在两种荧光轴的下半部分中可见。 连续，检查每个样本包括本机控制和FSC，SSC，APC和FITC数据存储每个样品至少10,000颗粒。 评价与相应的软件的数据。具体样品中的吸附变应原含量可以用两种方式来量化： 分析所有粒子（中值），为Bet v 1的负载超过所有PM10颗粒的量度的APC荧光强度。 注意：如果该特定样品含有变应原，APC荧光强度应在特定样品中的增加相比，阴性对照。与此相反，其它氟escence强度（ 例如 ，FITC荧光强度）应不显著变化。 计算PM10颗粒的结合的抗Bet v 1的抗体的百分比。从而，在阴性对照中，设置围绕考虑APC阳性颗粒的栅极，复制和这个门粘贴到特定样品和减去的APC阳性的粒子的比例在来自APC正粒子的具体样品中的百分比的阴性对照。