Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

1. La crescita di piante di Arabidopsis e il trattamento dello stress Preparare 1 L di Murashige e Skoog (MS) aggiungendo 4,3 g di MS Basal Salt miscela, 10 g di saccarosio, 0,5 g 2- (N-morfolino) etano solfonico (MES) in acqua deionizzata fino a 1 L e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungere 6 g di phytoagar e autoclave per 20 min a 120 ° C. Prima di solidificazione, versare il terreno in piastre di Petri rotonde (diametro 9 cm, altezza 1,5 cm, con 20 – 25 mL MS medio per piastra). Lasciare le piastre ad asciugare per ~ 1 h in una cappa a flusso laminare prima di chiudere le palpebre. Posizionare semi Arabidopsis thaliana in un mL provetta 1.5 per sterilizzazione superficiale aggiungendo 1 ml di 70% (v / v) etanolo contenente 0,02% (v / v) Triton X-100 e continuamente agitazione per 5-10 min. Per ciascun genotipo / condizione, preparare 10 piatti di Petri ogni trasportano ~ 100 – 150 piantine. Attendere circa 10 s fino a quando i semi si depositano alfondo del tubo, e quindi scartare il surnatante pipettando. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, e agitare nuovamente il tubo per 10 min. Preparare la cappa a flusso laminare, mentre i semi sono sterilizzando. Prendete un pezzo di carta da filtro per campione, piegarlo a metà per facilitare la semina, e immergerlo in 100% di etanolo nella cappa. Attendere che si asciughi completamente. Si noti che l'etanolo 100% è usato come evapora più velocemente del 70% di etanolo. Trasferire i semi sulla carta da filtro pipettando utilizzando un 1 ml punta della pipetta taglio ~ 5 mm dalla fine fine. Lasciarli asciugare, che dovrebbe prendere circa 10 – 15 min. Seminare ~ 100 – 150 semi sterilizzati in modo uniforme su ogni piatto MS medio Petri, e sigillare ogni piatto con del nastro adesivo chirurgico. Conservare le piastre a testa in giù a 4 ° C per 2 – 4 d incoraggiare e sincronizzare la germinazione. I vecchi semi possono avere bisogno di rimanere più a lungo (fino ad una settimana) a 4 ° C. Trasferire le piastre di una camera di coltura di tessuti vegetali e lasciarli a testa in su.Far crescere le piante per 8 d nell'ambito di un ciclo di lunga giornata (16 h 100 micromol · m – 2 · s – 1 luce, 8 h scuro) a 20 ° C. Per il trattamento di stress, quando le piante sono 8 d vecchia, nella cappa a flusso, trasferirli dal mezzo agar, da loro raschiando delicatamente a mano indossando guanti di etanolo-sterilizzati, in un pallone sterilizzato del mezzo MS liquido contenente il fattore di stress (ad esempio, 200 mm mannitolo). Evitare di portare su agar. Coprire bocca pallone in un foglio sterilizzato e consentono alle piante di crescere nelle stesse condizioni come al punto 1.8 per ulteriori 2 d su agitatore orbitale con agitazione delicata (~ 100 rpm). 2. Fare un proteina precursore in vitro Trascrizione / Traduzione Nota: Questo protocollo assume l'uso di Arabidopsis fotosistema I subunità D precursore (pPsaD) come modello / preproteina, ma il metodo è compatibile con gli altri. <ol> Clonare la sequenza codificante (CDS) del pPsaD nel sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore pBlueScript II SK (o qualsiasi altro vettore simile con un promotore T7 upstream) 13. Purificare il plasmide (pBSK-pPsaD) utilizzando un kit di isolamento del DNA e verificare la sequenza dal sequenziamento del DNA. NOTA: Tutte queste operazioni impiegano tecniche standard di clonazione molecolare. Determinare la concentrazione plasmide DNA pBSK-pPsaD utilizzando uno spettrofotometro impostato per misurare l'assorbanza a 260 nm. Diluire il plasmide ad una concentrazione finale di 10 ng / ml. Eseguire un 20 microlitri PCR (per 35 cicli) utilizzando il plasmide diluito come modello. Preparare la reazione nel modo seguente: 2 ml di buffer 10 × polimerasi, 2 microlitri 2 mM dNTP, 1 ml 5 mM M13 Forward Primer (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 ml 5 mM M13 primer reverse (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 ml diluito pBSK-pPsaD plasmide, 1 U Taq polimerasi, e acqua distillata per rendere il volume totale di reazione fino a20 ml. Utilizzare un programma PCR standard, come segue: 95 ° C, 5 min; 35 cicli di [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); e 72 ° C, 5 min. Eseguire 5 microlitri del prodotto di PCR su un 1% (w / v) gel di agarosio in TAE tampone (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM di acido acetico, 1 mM EDTA) per verificare la corretta amplificazione del cDNA, e quantificare il relativo banda rispetto agli standard per confermare la concentrazione. Conservare il resto del prodotto a -20 ° C per ulteriori applicazioni. Preparare una reazione di 50 microlitri utilizzando un sistema di reticolociti di coniglio lisato base privo di cellule di trascrizione / traduzione compatibile con PCR DNA, come segue: 40 microlitri lisato di reticolociti dal sistema di trascrizione / traduzione, 2,5 microlitri radiomarcato [35 S] metionina, 11 pCi / mL (attività specifica:> 1.000 Ci / mmol), acqua distillata 2,5 ml sterili, e 5 ml di prodotto pPsaD PCR (100-800 ng). Attenzione: Indossare guanti, indumenti di laboratorio e vetro di sicurezzases durante la manipolazione di materiale radioattivo. Monitorare e decontaminare la superficie di lavoro e le attrezzature. Smaltire tutti i rifiuti radioattivi in ​​un contenitore per rifiuti approvato. Incubare la reazione per 90 min in un bagno d'acqua a 30 ° C. Arrestare la reazione ponendo il campione sul ghiaccio. Rimuovere 1 ml della reazione come campione di prova (lo stesso volume può anche servire come un controllo di input per step 5.7) per la verifica su gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide standard (SDS-PAGE) seguita da autoradiografia, fluorography o l'imaging fosforo. Un buon risultato è indicato dalla osservazione di una banda distinta e forte corrispondente al peso molecolare di pPsaD (~ 23 kD). Conservare il resto della reazione a -80 ° C per ulteriori applicazioni. 3. Isolamento Cloroplasto Preparare le seguenti soluzioni madre: Preparare isolamento Cloroplasto Buffer (CIB, 2x): 0.6 M sorbitolo, 10 mM cloruro di magnesio(MgCl 2), 10 mM glicole etilenico tetraacetico (EGTA), 10 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 20 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO 3), 40 mm 4- (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico acido (HEPES) ; regolare a pH 8,0 con KOH. Preparare 2 L di 2x CIB, fare aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine. Per rendere 1x CIB, diluire il 2x CIB 1: 1 con acqua distillata; questo può essere preparato fresco il giorno dell'esperimento isolamento cloroplasto. Preparare HEPES-MgSO 4 -Sorbitolo tampone (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM solfato di magnesio (MgSO 4), 0,3 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con idrossido di sodio (NaOH). Preparare 400 ml di tampone, rendere aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine. Effettuare tutte le seguenti procedure nella cella o su ghiaccio. Preraffreddare tutte le soluzioni, dispositivi, attrezzature, e rotori prima starting. Preparare un gradiente di densità continua miscelando 13 ml di Percoll, 13 mL 2x CIB buffer e 5 mg di glutatione in una provetta da centrifuga 50, e centrifugando la miscela a 43.000 xg per 30 min (freno off) a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, gestire il tubo con cura per evitare di disturbare il gradiente e tenerlo in ghiaccio per un uso successivo. Trasferire 100 ml di 1x CIB per il genotipo / condizione a un 1 L bicchiere. Rimuovere le piantine dal mezzo liquido da loro ribaltamento in un setaccio, e trasferirli in un altro bicchiere CIB contenenti; poi, risciacquare il tessuto con il CIB per rimuovere liquido residuo prima di sostituirla con 100 mL di CIB fresco. Per omogeneizzazione, usare un totale di 100 ml di 1x CIB per campione in cinque turni consecutivi di omogeneizzazione, ogni turno usando 20 mL di CIB fresche presenti in un bicchiere da 50 ml. Per il primo turno di omogeneizzazione, trasferire il tessuto vegetale nel beaker da 50 ml a mano, consentendo laPrecedente buffer di detenzione di defluire attraverso le dita. Provate ad utilizzare la maggior parte del tessuto al primo turno, ma assicurarsi che sia immerso con tampone; se ciò non è possibile, introdurre il tessuto non utilizzato residuo al secondo turno. Posizionare sonda del omogeneizzatore tessuto nel tessuto e omogeneizzare con due impulsi di 1 – 2 s ciascuna. Filtrare l'omogeneizzato attraverso due strati di tessuto di filtrazione in un 250 mL provetta delicatamente spremitura. Conservare il filtrato, e trasferire il tessuto indietro al ml bicchiere da 50. Posizionare un secondo 20 ml CIB aliquota in ml bicchiere 50, l'aggiunta di qualsiasi tessuto rimanente non utilizzato nel primo turno di omogeneizzazione, e ripetere la procedura di omogeneizzazione e filtrazione. Quindi, ripetere i punti 3.5 e 3.6 fino a quando tutti i 100 ml di CIB è stata utilizzata (ad esempio, 5 aliquote di 20 ml), e combinare i filtrati risultanti. Centrifugare l'omogeneizzato pool a 1.000 g per 5 min (freno) a 4 ° C, e versare offil surnatante immediatamente dopo il completamento della centrifugazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet nel surnatante residua nella provetta agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Non risospendere vigorosamente pipettando o vortex. trasferire delicatamente l'omogeneizzato sulla parte superiore del gradiente di densità continua premade, usando una pipetta Pasteur per applicarlo attraverso la parete del tubo ricevente. Evitare di disturbare il gradiente. Centrifugare in un rotore oscillante secchio a 7.800 xg per 10 min (freno off) a 4 ° C. NOTA: Due bande verdi possono essere visti nel gradiente dopo la centrifugazione: la banda inferiore contiene cloroplasti intatti, e la banda superiore contiene cloroplasti rotti. Eliminare la banda superiore pipettando, e poi trasferire la banda inferiore con una pipetta Pasteur in un fresco 50 mL provetta da centrifuga, mantenendo un volume di fino a 8 ml per gradiente. Aggiungi ~ 25 ml di 1x HMS tampone nel tubo e capovolgere il tubo per due volte to lavare il Percoll dai cloroplasti. Riposizionare il tubo nel rotore oscillante-benna e centrifugare a 1000 g per 5 min (freno) a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con cura dei cloroplasti nelle HMS residua nel tubo agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Aggiungere ulteriori 100 – 300 ml di HMS se necessario (in base alle dimensioni del pellet e il conteggio nella sezione 4), ma cercate di non diluire il campione troppo. Mantenere i cloroplasti sul ghiaccio. Ogni volta prima che i cloroplasti sono utilizzati per applicazioni a valle, agitare il tubo per sospendere di nuovo loro. Usare sempre un puntale di taglio (con pori allargata) per trasferire i cloroplasti. 4. Analisi del rendimento e integrità dei cloroplasti Aggiungere 5 ml di cloroplasti isolati a 495 microlitri di buffer di 1x HMS in una provetta da 1,5 ml, e poi mescolare delicatamente invertendo il tubo per ottenere una diluizione 1: 100. PlaCe un vetro di copertura sulla sommità della camera di conteggio del dell'emocitometro. Lentamente pipetta ~ 40 – 60 microlitri della sospensione cloroplasto diluita nella fessura tra il vetro di copertura e la camera di conteggio. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X o 20X, cloroplasti intatte aspetto rotondo e luminose e sono circondate da un alone di luce. NOTA: Sotto il microscopio, vi è un'area di 1 mm 2 conteggio con 25 grandi piazze, ciascuno contenente 16 piccoli piazze del centro della camera di conteggio. Contare il numero di cloroplasti in 10 grandi piazze. Il numero di cloroplasti per piazzale dovrebbe media tra il 10 e il 30. Se troppo pochi o troppi cloroplasti sono presenti, regolare il fattore di diluizione (al punto 4.1) di conseguenza, e ripetere la procedura. Calcolare il numero di cloroplasti per ml (concentrazione) come segue: n (il numero medio di cloroplasti per piazzale calcolata al punto 4.3) × 25 (numero totale di grandi piazze) × 100 (il fattore di diluizione) × 10 4 (fattore di scala per esprimere i dati per 1 ml, in quanto il volume di sopra dei 25 quadrati è di 0,1 mm 3). Calcolare la resa effettiva dei cloroplasti moltiplicando la concentrazione del volume di sospensione cloroplasto ottenuta nello stadio 3.12. Normalmente, più di 50 × 10 6 cloroplasti possono essere ottenuti. 5. Cloroplasto proteine ​​Import Preparare le seguenti soluzioni madre: Preparare 10x HMS buffer: 500 mm HEPES, 30 mM MgSO 4 e 3.0 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con NaOH. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine e a 4 ° C per una conservazione a breve termine. Preparare Importa buffer di arresto: 50 mm EDTA sciolto in 1x HMS buffer. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C. Preparare 2x tampone proteico caricamento: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glicerolo, 2% (w/ V) di SDS, 0,005% (w / v) di bromofenolo blu. Fare 50 ml, e conservare a 4 ° C. Appena prima dell'uso, aggiungere 100 ml di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT) a 900 ml di tampone. Per eseguire una volta portate con 3 punti temporali, preparare 3 tubetti contenenti ciascuno una un'aliquota 130 ml di tampone arresto di importazione, e lasciarli sul ghiaccio. Preparare una reazione di importazione 450 microlitri in un tubo di 2 ml (per genotipo / condizione). Scongelare tutti gli ingredienti appena prima dell'uso. Per una reazione di importazione, di solito utilizzare 10 × 10 6 cloroplasti in un volume microlitri; per esempio, se la concentrazione cloroplasto è 2,5 × 10 8 / mL, utilizzare 40 microlitri di sospensione cloroplasto. Tre punti temporali avranno bisogno di 3 × A microlitri (ad esempio, 120 ml nel nostro esempio). Miscelare i componenti reazioni sul ghiaccio nel seguente ordine: acqua distillata (per rendere il volume totale di 600 microlitri), B microlitri 10x HMS tampone (dove B = [600-3 × A] / 10, cioè 48 nel nostro esempio), 12 microlitri1 M di acido gluconico (sale di potassio), 6 ml 1 M NaHCO 3, 6 microlitri 20% (w / v) BSA, 30 microlitri 100 mM adenosina 5'-trifosfato sale di magnesio (MgATP), 24 microlitri 250 mM metionina (non radiomarcato ), e 30 microlitri proteina precursore. Immediatamente prima di iniziare la reazione di importazione, aggiungere 3 × Un ml di cloroplasti e mescolare picchiettando delicatamente il tubo. Incubare la provetta di reazione a 25 ° C in un bagno di acqua sotto 100 mmol · m – 2 · s – 1 luce. Di tanto in tanto sfogliare i tubi per risospendere cloroplasti. Per condurre un time-corso, ritirare 130 aliquote microlitri dalla reazione al time-punti richiesti entro il campo lineare di importazione, che per pPsaD è fino a ~ 12 min (4, 8 e 12 min di tempo sono adatti in questo caso). Il periodo di gamma lineare può variare per diverse proteine 14. Pertanto, si suggerisce di verifica di ogni singolo preproteina prima di ottimizzare tlui punti di tempo. Subito dopo il ritiro, trasferire ogni aliquota 130 ml ad un tubo di tampone arresto importazione ghiacciata, Mescolare agitando leggermente il tubo, e mantenere tutti i tubi in ghiaccio fino al momento-corso è stato completato. Centrifuga tutti i campioni per 30 s a 12.000 × g in una microcentrifuga, scartare il surnatante pipettando, e pellet risospendere in 15 ml di 2x tampone proteico di carico con il vortex. Analizzare tutti i campioni, più il controllo di input pPsaD (contenente pPsaD pari al 10% dell'importo aggiunto per ogni reazione di importazione, dal punto 2.7) secondo le norme SDS-PAGE e autoradiografia, fluorography o immagini fosforo 15. Utilizzare immagine software di analisi per quantificare e analizzare i risultati. Per fornire un'indicazione dell'efficienza importazione, la quantità di proteina importato in differenti genotipi / condizioni può essere valutata misurando la radioattività associata con ciascuna banda maturo.