Анализы для изучения роли Vitronectin в бактериальной адгезии и сопротивление сыворотки
Summary
В настоящем докладе описываются протоколы для характеризующие взаимодействия между бактериальной внешней мембранных белков и vitronectin регулятор человека дополнением. Протоколы могут использоваться для изучения реакции связывания и биологические функции vitronectin в любых бактериальных видов.
Abstract
Бактерии использовать дополнение регуляторы в качестве средства уклонения от иммунного ответа. Здесь мы описываем протоколы для оценки роли vitronectin приобретения в бактериальной клетке поверхности играет в сопротивление иммунной системы. Потока цитометрии эксперименты определены человеческой плазмы vitronectin как лиганд для белка наружной мембраны бактерий рецептор H Haemophilus influenzae типа f. Энзим соединенный assay иммуносорбента был нанят характеризовать белок белковых взаимодействий между очищенной рекомбинантных белков H и vitronectin, и обязательного соответствия была оценена с помощью био слоя интерферометрии. Биологическое значение привязки vitronectin белка H на поверхности бактериальных клеток в уклонение иммунного ответа было подтверждено с помощью пробирного сопротивления сыворотки с нормальным и vitronectin истощены человеческой сыворотки. Значение vitronectin в бактериальных присоединения был проанализирован с использованием стекла слайды с и без vitronectin покрытия, следуют грамм пятная. Наконец бактериальной адгезии клеток человека альвеолярного эпителия монослои было расследовано. Протоколы, описанные здесь может быть легко адаптирована к изучению любых бактериальных видов интерес.
Introduction
Vitronectin (Vn) является важным человека гликопротеин, участвующих в поддержании гомеостаза через регулирование фибринолитической системы. VN также функционирует как дополнение регулятор, подавляя терминала дополнением путь во время C5b6-7 комплекс формирования и C9 полимеризации. Было показано несколько бактериальных патогенов набирать Vn на поверхности клеток как средство противодействия дополнением осаждения1,2,3. Кроме того Vn функционирует как «сэндвич» молекула между бактериями и принимающих рецепторы эпителиальных клеток, способствуя присоединению и интернализации патогенов2,4,5. Связывание Vn к поверхности бактериальной клетки при посредничестве других в настоящее время неопознанные белков. Полностью определить функциональную роль Vn привязки в уклонение шланг иммунного ответа поэтому потребует идентификации Vn Рекрутинг белков.
Первым шагом в выявлении Vn связывающих белков является для тестирования ли возбудитель интереса можно привязать очищенный В.н. проточной цитометрии удобный и простой метод, чтобы определить, привязан ли Vn возбудителя клетки. В этом исследовании мы оценивали привязки Vn различных клинических изолятов Haemophilus influenzae типа f (Hif)6. Метод, описанный здесь количественных и может использоваться для различения связывающая способность широкого спектра бактериальных штаммов. В предыдущем исследовании мы охарактеризовал белка H (рН) Hif как Vn связывания белка7. Таким образом в настоящем исследовании, Vn привязки потенциал одичал тип (WT) Hif и Hif M10ΔЛПХ мутанты были сопоставлены с использованием описанных протоколов.
После того, как выясняется, что возбудитель связывает Vn, второй шаг должен характеризовать поверхности протеома с целью выявления потенциальных Vn связывающих белков. Различные подходы могут быть использованы для этой цели8,9, но эти методологии не описаны в настоящем докладе. Метод, наиболее подходящий для изучения взаимодействия протеин протеина является recombinantly выразить выбранный бактериальных белков на поверхности в E. coli и очищают хромотографией сродства. Здесь мы используем PH и ее молекулярного взаимодействия с Vn проиллюстрировать метод. Взаимодействие между рекомбинантных PH и ВН были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)7 и недавно разработанных лейбл свободный метод, известный как био слоя интерферометрии (BLI)10,11. В то время как ELISAs может использоваться для подтверждения белок белковых взаимодействий, BLI предоставляет подробные данные относительно кинетические параметры взаимодействия.
Для изучения функциональной роли Vn бактериальных соблюдения, могут быть использованы два разных анализов. Первая проба, описанные здесь является прямое измерение бактериальной присоединения к Vn покрытием стеклянных поверхностей, в то время как второй assay рассматривает присоединение к поверхности эпителиальных клеток. Для первого assay стекло слайды были покрыты Vn, и связывание WT или мутантных штаммов Hif оценивали по Граму и микроскопии. Этот метод легко различает бактерии, основанный на способности связать Vn12. Бактериальной адгезии клеток млекопитающих затем анализируется путем добавления искусственного бактерий на монослое типа II альвеолярных клеток эпителия; Бактериальные вложение оценивалась путем подсчета количества формирования колонии единиц (CFUs). Соблюдаться и интернализированных бактерии могут быть выделены в наличие или отсутствие Vn4,13.
Роль Vn приобретения в бактериальных сыворотки сопротивление было оцениваются с помощью пробирного убийство сыворотки (то есть, бактерицидную активность сыворотки). Чтобы оценить значение Vn приобретения в сыворотке сопротивления, бактерицидная активность сыворотки, Vn истощены (VDS) был по сравнению с нормальной человеческой сыворотки (NHS). Метод, используемый легко отличает Vn привязки против обязательной бактерий на основе сыворотки сопротивления. Мы использовали этот метод для изучения роли Vn в сыворотке сопротивление ряда бактериальных патогенов4,12.
Были зарегистрированы многочисленные методы для изучения взаимодействия хост патогена. Здесь мы описывают набор протоколов, которые могут быть легко адаптированы к изучению любых возбудитель для того, чтобы оценить роль в патогенезе Vn. Мы проверили эти протоколы, используя различные патогенные микроорганизмы, и Hif была выбрана в качестве примера для этого отчета.
Protocol
Representative Results
Discussion
Патогенные набирать Vn на поверхности клетки и использовать этот регулятор дополнением для предотвращения осаждения факторов комплемента и завершения комплекс мембраны нападение2. VN также функционирует как молекула мост между бактериальных белков на поверхности и прини?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана гранты от фонда Анна и Эдвин Бергер, Ларс Hierta, о.е. и Эдла Йоханссон фонд, шведский Совет медицинских исследований (Грант номер K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Фонд рака в университете Больница в Мальмё, физиографические общества (Forssman в фонд) и Совет графства Сконе исследований и Фонд развития.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
Referências
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
