Summary

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Abstract

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) son gelişme olgun somatik hücreler farklılaşmamış bir, pluripotent duruma geri kanıtladı. İlk deneyler, genellikle deri fibroblast ile yapıldı vb keratinositler, idrar hücreler, fibroblastlar, Şimdi, yeniden programlama çeşitli yetişkin somatik hücre tipleri ile yapılır. Ancak, bu hastaların fibroblastlar elde etmek için invazif cerrahi prosedür gerekli. Bu nedenle, kan ve idrar hücreleri gibi süspansiyon hücreleri, çünkü birincil hücreler elde rahatlık yeniden programlama için ideal olarak kabul edildi. Burada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için iPSC üretilmesi için etkili bir yöntem sunulmaktadır. Yeni, matris kaplı plaka kullanılarak santrifüj seri olarak transduced PBMC'ler kaplama olarak, bu protokol kolayca iPSC koloniler sağlayabilir. Bu yöntem aynı zamanda göbek kordonu kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMCs) için de geçerlidir. Bu çalışma, basit ve etkili bir Prot sunarPBMC'ler ve CBMCs yeniden programlanmasını ocol.

Introduction

Kök hücreleri, son birkaç on yıl 1 Klinik terapisinde en cazip malzemelerden biri olmuştur. Kök hücrelerin çekici özellikleri Pluripotency ve kendini yenilemek yeteneği vardır. 1981 yılında ilk embriyonik kök hücrelerin (ESCs) fare embriyo 2 izole edilmiştir. teknik insan embriyosunun uygulanmıştır Ancak, birkaç etik konuları karşılaştı.

Dr. Yamanaka ve ekibi fare somatik hücrelerden ilk pluripotent hücre reprogrammed zaman 2006 yılında, kök hücre alanı kendi imkanı kazanmış ve faiz 3 canlanan edildi. Birkaç tanımlanmış faktörleri teslim ederek, pluripotent kök hücreler başarıyla yetişkin somatik hücrelerden "uyarılmış" olduğunu ve böylece adlandırılmıştır "(iPSCs) uyarılmış pluripotent kök hücreler." 2007 yılında, bu teknik EKH kesin özelliklere sahip hücreler üreterek, insan hücrelerinde 4 uygulanmış fakat etik tartışmaların hiçbiri. Teorik olarak, iPSCs herhangi bir birey veya hastadan elde edilen herhangi bir hücre tipinden oluşturulabilir. Hastaya özel iPSCs hastalık fenotipleri ve her hastanın epigenetik koşullarını taklit edebilirsiniz potansiyel bir araç olarak artıyor. Gen düzenleme veya patojenik durumu tersine çevirmek için başka yöntemler kullanılarak, hastaya özel iPSCs, kişiselleştirilmiş ilaç 5 kullanılabilir. Bunlar 6 otomatik nakli daha uygun hale verici ile aynı bağışıklık kimliğe sahip çünkü Ayrıca, iPSCs az bağışıklık reddi ile ilişkilidir. Bu nedenle, iPSCs hastalık modelleme, ilaç tarama ve rejeneratif tedaviler en umut verici bir platform haline gelmiştir. Bu faydaları, sürekli geliştirilmekte olan küçük hücre kaynağından zaman az miktarda daha saf ve daha yüksek verim verebilir geliştirilmiş protokoller göz önüne alındığında. Gelecekteki uygulama için en verimli protokol bulma biri önemli unsurlardan primer hücre tipidir. Erken iPSC üretimi proto çoğucols orijinal iPSC hatları deri fibroblastları 4 indüklenen beri yapışık hücreler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin izole edilmesi ve hazırlanması, emek yoğun işlemlerdir. Ayrıca, cilt fibroblast izolasyonu daha geniş bir uygulama için büyük bir eksiklik olabilir invaziv cerrahi prosedürleri içermektedir.

Bu nedenle, iPSCs ve daha fazla kullanım için, uygun edinimi ile bir hücre kaynağı gereklidir. Bu oldukça minimal invaziv prosedür 7-9 ile elde edilir çünkü kan ideal bir hücre kaynağı olarak kabul edilir. Bu çalışmada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için hiPSCs üreten protokole basit modifikasyon geliştirdi. Bu CD34 + hücreleri gibi belirli bir hücre tipi, zor genişletme işlemi olmadan, tam kan hücreleri veya PBMC'ler seri Yamanaka faktörleri içeren Sendai virüsü ile transdüksiyon sonra santrifüjleme ile matris kaplı plakalar üzerine kaplandı. Bu yöntem için gerekli süre azalırtransduse yüzen hücreleri bağlanma ve kendi eklemek mümkün değildi yeniden programlanan hücrelerin kaybı azalmıştır.

Protocol

Etik Beyanı: Bu çalışma protokolü Kore Katolik Üniversitesi (KC12TISI0861) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Kandan Monositik Hücreleri 1. İzolasyon monositik hücrelerin izolasyonu (Gün -5) Bir hücre hazırlama borusu (CPT) ve kan alımı taze kan, en az 10 ml elde etmek. Yeni 50-ml'lik konik tüpe kan transferi ve 1 steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş: 4 oranında. NOT: seyreltme oranının daha yüksek daha yüksek bir sa…

Representative Results

Bu protokol kanından izole PBMC'ler yeniden programlamak için basit bir yöntem sunar. Seri kaplama ve santrifüj kombinasyonu kullanılarak, iPSCs başarıyla üretildi. Bu yöntemle, iPSCs izole edilmesi ya da belirli bir hücre tipi genişletmeden tam kan hücrelerinin küçük bir miktar ile oluşturulabilir. Başarıyla küçük hücre kültürü plakasının sadece 1×10 4 hücrelerinden iPSCs oluşturulur. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1…

Discussion

Embriyonik kök hücreler (ESCs) birçok takım eksiklikler göstermiştir için, alternatif bir araca gerek gerekmiştir. Bu nedenle, Yamanaka tarafından uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin gelişimi (iPSCs) uluslararası mercek altına geldi. Yamanaka Pluripotency yetişkin somatik hücre içine sadece dört gen ekleyerek uyarılan edilebileceğini keşfetti beri neredeyse on yıl olmuştur. iPSCs olgun somatik hücrelerden "uyarılmış" olduklarından, bir zamanlar EKH ilgili endişe olmuştu etik…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

Referências

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
check_url/pt/54650?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

View Video