Summary

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Abstract

人間の人工多能性幹細胞(hiPSCs)の最近の開発は成熟した体細胞が未分化多能性の状態に戻ることができることを証明しました。 などケラチノサイト、尿細胞、線維芽細胞、初期の実験は、通常、皮膚線維芽細胞を用いて行った:今、再プログラミングは、成体の体細胞の様々なタイプを使用して行われます。しかしながら、これは、患者からの線維芽細胞を得るために侵襲的な外科的処置を必要としました。したがって、そのような血液および尿細胞などの懸濁細胞を、なぜなら一次細胞を得るための利便性の再プログラミングのために理想的と考えられました。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)からのIPSCを生成するための効率的なプロトコルを報告します。遠心分離を使用して、新しい、マトリックスでコーティングされたプレートにシリアルに形質導入したPBMCをメッキすることにより、このプロトコルは、簡単にIPSCのコロニーを提供することができます。この方法はまた、臍帯血単核細胞(CBMCs)にも適用可能です。この研究は、シンプルかつ効率的PROTを提示しますPBMCおよびCBMCsの再プログラミングのためのocol。

Introduction

幹細胞は、過去数十年の1のための臨床治療の中で最も魅力的な材料の一つとなっています。幹細胞の魅力的な特性は、多分化能と自己再生する能力です。 1981年、第一の胚性幹細胞(ESC)は、マウス胚2から単離しました。技術は、ヒト胚に適用した場合しかし、それはいくつかの倫理的な問題に直面しました。

博士は山中と彼のチームは、マウスの体細胞から最初の多能性細胞を再プログラムするとき、2006年に、幹細胞のフィールドは、その可能性を取り戻し、関心が3が再燃ました。いくつかの定義された因子を送達することによって、多能性幹細胞は、成体体細胞から「誘導され」、したがって、命名された成功した「人工多能性幹細胞(iPS細胞)」を2007年には、この技術は、ESCの正確な特徴を有する細胞を得、ヒト細胞4に適用されたが、倫理的な議論のどれも。理論的には、のiPSCsは、任意の個体または患者から得られる任意の細胞型から生成することができます。患者特異的iPS細胞は、疾患の表現型および個々の患者のエピジェネティックな条件をシミュレートすることができます潜在的なツールとして上昇しています。遺伝子編集または病原性の状態を逆にすることができ、他の方法を使用して、患者特異的iPS細胞はまた、オーダーメイド医療5で使用することができます。彼らはドナーと同じ免疫アイデンティティを持っているので、また、性IPSCは少ない6自動移植より現実作り、免疫拒絶と関連しています。したがって、性IPSCは、疾患のモデリング、薬剤スクリーニング、および再生治療で最も有望なプラットフォームとなっています。これらの利点を考慮すると、最小の細胞源から最短の時間でより純粋な、より高い収率を与えることができる改良されたプロトコルが開発中で常にあります。将来のアプリケーションのための最も効率的なプロトコルを見つけることの1つの主要な考慮事項は、主要な細胞型です。早期IPSC生成プロトの大半colsのは、元のIPSCラインが皮膚線維芽細胞4から誘導されたので、接着細胞用に最適化されています。しかし、これらの細胞の単離および調製は、労働集約的です。また、皮膚線維芽細胞の単離は、より広範なアプリケーションのための主要な欠点になることができます侵襲性外科手術手順が含まれています。

したがって、iPS細胞をさらなる使用のために、便利な収集を有する細胞源が必要とされます。それはむしろ低侵襲手順7-9を介して取得されるので、血液は、理想的な細胞源とみなされます。本研究では、末梢血単核細胞(PBMC)からhiPSCs生成プロトコルに簡単な変更を開発しました。そのようなCD34 +細胞のような特定の細胞型の困難な膨張処理なしで、全血細胞またはPBMCを連続山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入した後、遠心分離によりマトリックスでコーティングされたプレート上にプレーティングしました。この方法は、に必要な時間を減少しました形質導入浮遊細胞の付着とは、自分で取り付けることができませんでした再プログラミングされた細胞の損失を減少させました。

Protocol

倫理に関する声明:本研究プロトコルは、カトリック大学校(KC12TISI0861)の施設内倫理委員会によって承認されました。 血からの単球細胞の1の単離単球細胞の単離(日-5) 細胞調製チューブ(CPT)に採血から新鮮な血液の少なくとも10ミリリットルを取得します。 新しい50mlのコニカルチューブに血液を移し、1で滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれを希釈:4の?…

Representative Results

このプロトコルは、血液から単離したPBMCを再プログラムするための簡単な方法を提示します。シリアルめっきおよび遠心分離の組み合わせを使用して、iPS細胞が正常に生成されました。この方法では、性IPSCは、特定の細胞型を単離するか、拡大することなく、全血細胞の少量生成することができます。我々は成功し、小細胞培養プレートにのみ1×10 4個の…

Discussion

胚性幹細胞(ESC)は、いくつかの欠点を示しているので、代替ツールの必要性が必要とされました。したがって、山中によって誘導多能性幹細胞(iPS細胞)の開発が国際的なスポットライトの下に来ました。山中は、多能性成体体細胞にのみ4つの遺伝子を添加することによって誘導することができることを発見して以来、約10年間でした。 iPS細胞は、成熟した体細胞から「誘導され」ている…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

Referências

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
check_url/pt/54650?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

View Video