الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
أثبتت التطورات الأخيرة من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) أن الخلايا الجسمية الناضجة يمكن ان يعود الى وجود دولة المحفزة غير متمايزة. الآن، ويتم إعادة برمجة مع أنواع مختلفة من الخلايا الجسدية للبالغين: الكيراتينية والخلايا البول، والخلايا الليفية، الخ وعادة ما فعلت التجارب المبكرة مع الخلايا الليفية الجلدية. ومع ذلك، وهذا يتطلب إجراء العمليات الجراحية الغازية للحصول على الخلايا الليفية من المرضى. لذلك، فإن الخلايا تعليق، مثل خلايا الدم والبول، واعتبرت مثالية لإعادة البرمجة وذلك بسبب سهولة الحصول على الخلايا الأولية. هنا، ونحن التقرير بروتوكول كفاءة لتوليد IPSC من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs). بواسطة الطلاء وPBMCs transduced متسلسل ل، لوحة باستخدام الطرد المركزي الجديدة المغلفة المصفوفة، يمكن هذا البروتوكول بسهولة توفير المستعمرات التوجيهية. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على خلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMCs). وتقدم هذه الدراسة بروت بسيطة وفعالةocol لإعادة برمجة PBMCs وCBMCs.
Introduction
وكانت الخلايا الجذعية واحدة من المواد الأكثر جاذبية في العلاج السريري لمشاركة عدة عقود 1. خصائص جذابة للخلايا الجذعية تعدد القدرات والقدرة على تجديد الذات. في عام 1981، تم عزل أول الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) من جنين فأر 2. ومع ذلك، عندما تم تطبيق هذه التقنية لأجنة بشرية، واجهت العديد من القضايا الأخلاقية.
في عام 2006، عندما برمجة الدكتور ياماناكا وفريقه أول خلية المحفزة من الخلايا الجسدية الماوس، استعاد مجال الخلايا الجذعية إمكانية ووانتعشت الفائدة 3. من خلال تقديم العديد من العوامل المحددة، وكانت الخلايا الجذعية المحفزة بنجاح "التي يسببها" من الخلايا الجسدية للبالغين، ووهكذا اسمه "الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs)." في عام 2007، تم تطبيق هذا الأسلوب على الخلايا البشرية 4، مما أسفر عن الخلايا التي تحتوي على الخصائص الدقيقة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية ولكن أيا من النقاش الأخلاقي. من الناحية النظرية، الجذعخدمات العملاء يمكن أن تتولد من أي نوع من الخلايا التي تم الحصول عليها من أي فرد أو المريض. iPSCs-مريض معين ترتفع كأداة المحتملة التي يمكن محاكاة الظواهر المرض والظروف جينية من كل مريض على حدة. عن طريق تحرير الجينات أو غيرها من الوسائل التي يمكن عكس حالة المسببة للأمراض، iPSCs المريض محددة يمكن أيضا أن تستخدم في الطب الشخصية 5. وعلاوة على ذلك، فإن أقل المرتبطة iPSCs مع الرفض المناعي لأن لديهم نفس الهوية المناعية مثل المانحة، مما يجعل لصناعة السيارات في زرع أكثر جدوى 6. وبالتالي، أصبحت iPSCs منصة الواعدة في مجال النمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاجات التجدد. ونظرا لهذه الفوائد، وتحسين البروتوكولات التي يمكن أن تعطي أنقى وزيادة الغلة في أقل قدر من الوقت من مصدر خلية أصغر هي دائما تحت التطوير. أحد الاعتبارات الرئيسية في العثور على البروتوكول الأكثر كفاءة لتطبيقها في المستقبل هو نوع من الخلايا الأولية. معظم أوائل IPSC الجيل بروتوهي الأمثل العواميد لخلايا ملتصقة منذ خطوط التوجيهية الأصلية استميلت من الخلايا الليفية الجلد 4. ومع ذلك، فإن العزلة وإعداد هذه الخلايا هي كثيفة العمالة. أيضا، وعزل الخلايا الليفية الجلد وتشمل العمليات الجراحية الغازية التي يمكن أن تصبح أحد أوجه القصور الرئيسية لتطبيقها على نطاق أوسع.
لذلك، لاستخدام المزيد من iPSCs، لا بد من مصدر الخلية مع اكتساب مريحة. ويعتبر الدم كمصدر للخلايا المثالي منذ تم الحصول عليها من خلال إجراء بدلا مينيملي 7-9. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير تعديل بسيط لتوليد hiPSCs من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) البروتوكول. دون عملية التوسع صعبة من نوع خلية معينة، مثل الخلايا CD34 +، وخلايا الدم الكامل أو PBMCs كانت مطلية بشكل متسلسل على لوحات المغلفة مصفوفة بواسطة الطرد المركزي بعد تنبيغ مع فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل ياماناكا. خفضت هذه الطريقة الوقت اللازم لمرفق من الخلايا العائمة transduced وانخفض فقدان الخلايا المعاد برمجتها التي لم تكن قادرة على تولي بمفردهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) وأظهرت العديد من أوجه القصور، ويتطلب ضرورة وجود أداة بديلة. لذلك، جاءت تطور الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من خلال ياماناكا تحت الاضواء الدولية. وكان ما يقرب من عقد من الزمان منذ اكتشف ياماناكا …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Referências
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
