Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Hücreler sürekli birbirleri ile etkileşim biomacromolecules çok sayıda içerir. Bu ilişki, sinyal iletimi, gen ifadesi ve diğerleri arasında, hücre göçünün düzenlenmesinde işleyişi sorumlu hücre yoluna katılabilir kompleksleri yol açar. bir hücrede meydana gelen tüm protein-protein etkileşimleri interaktom bilinen bir ağ ihtiva eder. Saccharomyces cerevisiae'de de proteinlerin% 70'den fazla etkileşim ortakları ¹ sahip olduğu gösterilmiştir. Bir hücrenin interaktom anlamak ve fonksiyonları karmaşıklığı ve canlıların çeşitliliği ilgili bilgileri sağlar. Çeşitli metodolojiler, protein-protein etkileşimlerini belirlemek ve tanımlamak için tarif edilmiştir. Bu tür maya iki-hibrid ^2, protein fragmanı tamamlama deneyleri ^3, kütle spektrometrisi ve protein microarra bağlanmış afinite saflaştırma ⁴ olarak koyun yöntemlerle yüksek Farklıys bir etkileşim ^5,6 tanımlamak için kullanılır. tespit kez, bunu doğrulamak için gerekli olan ve bu bir vaka ile ayrı ayrı değişebilir. Tipik haliyle, bu deneyler, gen silinmesi veya proteinlerin bir aşırı ifadesi ile etkileşim çifti, örneğin, tek tek üyelerin seviyesinde, etkileşim kendisini kesintiye içerir, ve daha sonra diğer üyesinin özelliklerindeki değişiklik ya da işlev için ideal hücresel düzeyde. Daha sonra, biyo-fiziksel teknikler ⁷ moleküler düzeyde protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için kullanılır. kalorimetri ve floresan spektroskopi nicelik ve mekanik olarak bunları tarif etmek için kullanılır ise, bu amaca yönelik olarak, protein kompleksleri yapısı X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans ve kriyo-elektron mikroskobu ile tespit edilir.

Bu çalışmada, floresan anizotropi GTPaz EFL1 ve SBD arasındaki etkileşimi karakterize etmek için bir teknik olarak kullanılanS proteini. Bu proteinler, 60S ribozomal alt birim ⁸ yüzeyinden ökaryotik başlatma faktörünün 6 salınmasını teşvik ederek ribozomların sentezine katılmadığını. SBDS proteini EFL1 guanosin difosfata ^10,11 için afiniteye azaltılması için bir guanin nükleotid değişim faktörü olarak Shwachman-Diamond ^{sendromu, 9} ve hareket olarak bilinen bir hastalık mutasyona uğrar. SBD'ler Hastalık mutasyonlar EFL1 ile etkileşimi ortadan kaldırmak ve böylece aktivasyonunu engeller.

Floresans anisotropi yaygın protein peptid veya protein, nükleik asit etkileşimleri incelemek için biyolojik uygulamalarda kullanılır. Bir fluorofor kısmen polarize emisyon polarize ışık sonuçları ile heyecanlı olduğu ilkesine dayanmaktadır. Floresans anisotropi Denklem 1 ile tanımlanır:

Ben _VV ve _VH nerededikey ¹² ışık polarize ile örnek heyecanlı olduğunda dikey olarak _(VV) ve yatay _(VH) floresan yoğunlukları emisyonu polarize. Floresans anisotropi fluorofor dönme difüzyon hızını etkileyen faktörlere karşı duyarlıdır ve bu nedenle sıcaklık, çözelti viskozitesi ve fluorofor görünür molekül büyüklüğüne bağlıdır. başka protein ve böyle bir değişiklik ile etkileşime girdiğinde bir florofor artar içeren bir proteinin bariz boyutu daha sonra anizotropide bir değişiklik olarak değerlendirilebilir. Daha spesifik olarak, kendi floresan ömrü çözüm göreceli yavaş dönen bir fluorofor nispeten büyük bir anizotropi sergileyecek bu nedenle büyük bir ben _VV değeri ve küçük ben _VH değerine sahip olacak ve. Onların floresan ömrü hızla göreceli takla fluorophores için, _VV ve _VH benzer olacaktır ve bunların anizotropi değeri küçük olacaktır ¹² </sup> (Şekil 1). Buna ek olarak, gürültü ölçümü için iyi bir anizotropi sinyali için, ilgili molekülün dönme korelasyon zaman benzer bir floresan ömrü olan bir flüorofor olması gereklidir. Aksi takdirde, doğru bir kompleks serbest protein arasında ve anizotropi farkı kayıt yapmak mümkün değildir. Örneğin, 100 da düşük molekül ağırlıklı bir bileşiğin bağlanmış örneğin flöresin ve rodamin edildiği gibi 4 nsaniye yakın bir ömür süresi olan bir flüoresan probun anizotropi 0.05. kDa 0.29 olan anizotropi değerini artırır 160 bir moleküle bağlanması; doğru ölçülebilir bir fark. Bunun aksine, olan bir artış, moleküler boyut olarak değişmektedir 65 1.000 kDa bir bağlama reaksiyonda yer kişi aynı flüoresan prob sadece doğru bir şekilde ölçülmesi için çok küçük olan 0,3 0.28 bir anisotropi değişikliği ile sonuçlanacaktır. Bu senaryoda, 400 nsaniye bir ömür boyu bir prob ¹² daha uygun olacaktır.

Floresan uygulamaları ele moleküllerin herhangi bir fluorofor varlığını gerektirir. florofor üç türü vardır, protein-protein etkileşimleri incelemek için: 1) proteinleri içinde mevcut triptofan kalıntısı, 2), yeşil flüoresan protein (GFP) ve deriva gibi kimyasal bağlanmış fluorophores ve 3) flüoresan füzyon partnerleritives. Çoğu protein, yapısı bir etkileşimi ölçmek için en kolay yol, ilgili floresans spektrumları değişiklikleri izleyerek veya triptofan artıklarının floresan yoğunluğu değişiklikleri izleyerek, triptofanı kalıntılarına sahip olacak şekilde. Bununla birlikte, triptofan artıklarının analizi karmaşıklaştıran iki protein içinde mevcut olabilir. Bir fluorofor nedeniyle bir etkileşim onun floresan özelliklerini değiştirmek için Öte yandan, bu ya da bağlanma yeri yakınında bulunan gerekiyor ve bu etkileşim kendisi müdahale olabilir. GFP gibi hacimli fluorophores kullanıldığında bu özel dikkat gerektirir. Bu florofor hiçbiri bağlanma çalışmaları için kullanılabilir, bu süreden sonra katılan proteinlerin birine dışsal fluorophores tanıtmak gereklidir. Birçok kimyasal olarak sentezlenmiş fluorophores biri kovalent gibi amin grupları (bir lisin ya da N-terminal yan zincir) ve sistein tiyol grupları olarak reaktif gruplar yoluyla proteinlere bağlanabilir. Fiodoasetamid ve maleimid tiol-reaktif gruplar, ¹³ ise izotiyosiyanat ve süksinimidil esterlerin ile luorophore türevleri amid grubu ile reaksiyona girer. Floresan uygulamalarda en yaygın olarak kullanılan boya fluoresein türevleri ve rodamin, yeşil boya, kumarinler, BODIPY fluorophores ve Alexa Fluor boyalardır. Piyasada mevcut fluorophores ve bunların kullanımı ayrıntılı bir listesi referanslar ^14,15 bulunabilir. Başarılı bir etiketleme için, reaktif grup proteinin yüzeyi ile açık olmalıdır, fakat polipeptidler tipik olarak reaktif işlevsel grupların çok sayıda, mevkiye-özgü modifikasyonu almak çok zordur. Bu çalışmada, ilgili protein, SBDS, birden fazla site etiketleme ile sonuçlanabilir 5 serbest sistein ve 33 lisin bulunmaktadır. Sigara üniforma etiketleme bağlama etkileyebilir ve farklı fluorofor molekülleri bağlanması üzerine farklı floresan yoğunluğu sinyallerini ortaya çıkarabilir olarak veri analizi zorlaştıracaktır. ove içinBu sorunu rcome biz FLASH florofor, 4 'site doğrudan etiket, 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) floresein SBDS proteini kullanılır. Bu motifi X sistein ^16,17 dışında herhangi bir amino asit olduğu sekansı CCXXCC oluşan flaş etiketi olarak bilmek dört aralıklı sistein için büyük bir benzerliği olan bir arsenoxide boyadır. Bu Tetracysteine ​​motifi birlikte proteinin genel kat bozulmasını önlemek için, uygun bir bağlayıcı ile genetik mühendisliği ile N- veya proteinin C-terminaline ilave edilmiştir. FLASH boya ve FLASH etiketinin oluşan bir çift ilk hücreler ¹⁷ oturma yeri belirli etiket protein için tasarlanmıştır, ancak, aynı zamanda, burada örnek olarak olduğu gibi, in vitro olarak, saflaştırılmış proteinleri etiketlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, enzimatik stratejiler aynı zamanda, proteinlerin ¹⁸ site-spesifik işlevselleştirilmesini sağlamak için geliştirilmiştir.

Bu yazıda floresan anizotropi a yararlılığını açıklarsa aracı protein-protein etkileşimleri incelemek için. niceliksel bilgi deneysel verilerin uyum elde edilebilir ise ciltleme eğri şeklinin basit bir muayene ile değerlendirilebilmektedir.