タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

細胞は常に互いに相互作用の生体高分子の多くが含まれています。この関連付けは、シグナル伝達、遺伝子発現、およびとりわけ、細胞遊走の調節におけるそれらの機能を担当する細胞経路に関与する複合体を生じさせます。細胞内で発生するすべてのタンパク質 – タンパク質相互作用は、インタラクトームと呼ばれるネットワークを含みます。 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるそのタンパク質の70％以上は、相互作用パートナー^1を有すること^が示されています。セルとその機能のインタラクトームを理解することは、生物の複雑さと多様性に関連する情報を提供しています。いくつかの方法は、タンパク質 – タンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために記載されています。このような酵母ツーハイブリッド^2、タンパク質断片相補アッセイ^3、質量分析およびタンパク質microarraに結合されたアフィニティー精製⁴として置く方法による高異なりますYSは対話^5,6を識別するために使用されます。識別されると、それを検証するために必要であり、これはケースバイケースで変動し得ます。典型的には、これらの実験は、タンパク質の一つの遺伝子の欠失または過剰発現により、例えば 、相互作用ペアの個々のメンバーのレベルの相互作用自体を破壊し、その後で他のメンバーの性質又は機能の変化を探し含みます細胞レベル。その後、生物物理学的技術^7は、分子レベルでのタンパク質-タンパク質相互作用を特徴付けるために使用されます。熱量測定及び蛍光分光法を定量的及び機械的にそれらを記述するために使用されるこの目的のために、タンパク質複合体の構造は、X線結晶学、核磁気共鳴及び低温電子顕微鏡によって決定されます。

本研究では、蛍光異方性は、GTPアーゼEFL1とSBDとの間の相互作用を特徴づけるための手法として使用しましたSタンパク質。これらのタンパク質は、60Sリボソームサブユニット⁸の表面から真核生物の開始因子6のリリースを促進することによってリボソームの合成に参加しています。 SBDSタンパク質はShwachmanダイヤモンド症候群⁹として知られている疾患で変異し、EFL1がグアノシン二リン酸^10,11との親和性を減少させるためのグアニンヌクレオチド交換因子として作用します。 SBDSにおける疾患変異はEFL1との相互作用を廃止し、したがって、その活性化を防ぎます。

蛍光異方性は、一般的に、タンパク質 – ペプチド又はタンパク質 – 核酸相互作用を研究するために、生物学的用途で使用されます。これは、フルオロフォアは、部分的に偏光放射の偏光の結果で励起という原理に基づいています。蛍光異方性は、式1で定義されています。

I _VVと私_VHがある場所サンプルが垂直偏光¹²で励起されたときに、水平垂直_（VV）及び_（VH）の蛍光強度は、放射を偏光。蛍光異方性は、フルオロフォアの回転拡散の速度に影響を与える要因に敏感であり、したがって、温度、溶液の粘度およびフルオロフォアのみかけの分子サイズに依存します。それは他のタンパク質とそのような変化と相互作用するとき、フルオロフォア増加を含むタンパク質の見かけの大きさは、その後、異方性の変化として評価することができます。具体的には、その蛍光寿命を解決に相対ゆっくりと回転するフルオロフォアは、大きなI _VV値と小さなI _VHの値を持つことになりますので、比較的大きな異方性を示すであろう。急速に蛍光寿命を基準に転落蛍光団のために、私_VVと私_VHは同様であろうとその異方性値が小さい¹²になります</sup>（ 図1）。また、ノイズ測定に優れた異方性信号のために、目的の分子の回転相関時間と同様の蛍光寿命を有する蛍光団を有することが必要です。そうでなければ、正確に遊離タンパク質との複合体中のそれとの間の異方性の差を記録することは不可能です。例えば、100ダの低分子量化合物に結合し、フルオレセインやローダミンなどの4ナノ秒に近い寿命を持つ蛍光プローブの異方性が0.05です。 160キロダルトンの分子に結合すると、0.29にその異方性値が増加します。正確に測定することができる差。これとは対照的に、その増加分子の大きさで変化する65〜1000キロダルトンへの結合反応に関与し、同じ蛍光プローブは正確に測定するには小さすぎるです0.3から0.28の異方性の変化、になります。このシナリオでは、400ナノ秒の寿命を有するプローブは^、12より適切であろう。

蛍光用途が研究分子のいずれかでフルオロフォアの存在を必要とします。フルオロフォアの三種類があるタンパク質 – タンパク質相互作用を研究するために：1）タンパク質中に存在するトリプトファン残基、2）、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのderivaように化学的に結合フルオロフォアおよび3）、蛍光融合パートナーティブ。ほとんどのタンパク質は、その構造上のトリプトファン残基を有し、従って、相互作用を測定する最も簡単な方法は、対応する蛍光スペクトルの変化を監視することにより、またはトリプトファン残基の蛍光強度の変化を監視することによってです。しかし、トリプトファン残基の分析を複雑に両方のタンパク質中に存在してもよいです。フルオロフォアによる相互作用、その蛍光特性を変化する一方、または結合部位の近くに位置する必要があり、それが相互作用自体を妨害する可能性があります。 GFPなどのかさばるフルオロフォアを使用する場合に特別な注意が必要です。これらの蛍光体のいずれもが結合研究のために使用できない場合には、その後、関連するタンパク質の一つに外因性蛍光団を導入することが必要です。多くの化学的に合成されたフルオロフォアが存在し、共有結合、アミン基（リジンまたはN末端の側鎖）およびシステイン中のチオール基のようなそれらの反応基を介してタンパク質に結合させることができます。 Fヨードアセトアミドおよびマレイミドは、チオール反応性基¹³でありながら、イソチオシアネートおよびスクシンイミジルエステルとluorophore誘導体は、アミド基と反応します。蛍光用途で使用される最も一般的な色素は、フルオレセインの誘導体およびローダミングリーン色素、クマリン、BODIPYフルオロフォアおよびアレクサフルオロ色素です。市販のフルオロフォアおよびその使用の詳細なリストは、参考文献^14,15に記載されています。成功した標識のために、反応性基は、タンパク質の表面に露出する必要がありますが、原因のポリペプチドに典型的に存在する反応性官能基の数が多いため、部位特異的修飾を得ることは非常に困難です。本研究における目的のタンパク質は、SBDS、複数のサイトの標識をもたらすことができる5遊離システインと33のリジンが含まれています。不均一な標識は、結合に影響を与えることができ、異なるフルオロフォア分子が結合時に異なる蛍光強度信号を引き出すことができるようにデータ解析を複雑にします。 OVEするにはこの問題をrcome、我々はサイトの直接ラベルに、SBDSタンパク質を4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセインをフラッシュフルオロフォアを使用していました。これは、フラッシュタグは、Xは、システイン^16,17以外の任意のアミノ酸である配列CCXXCCからなるとしても知らモチーフの4つの離間したシステインに対して高い親和性を有するarsenoxide色素です。このテトラシステインモチーフは、タンパク質の全体的な折り畳みの破壊を防止するために一緒に適切なリンカーとN末端または遺伝子工学によるタンパク質のC末端に付加されています。フラッシュ染料とフラッシュタグのペアは、もともと生細胞¹⁷に、サイト固有のラベルタンパク質に設計されていたが、それはここで例示されているとして、また、 インビトロで精製されたタンパク質を標識するために使用することができます。また、酵素の戦略はまた、タンパク質¹⁸の部位特異的官能化を可能にするために開発されてきました。

本稿では、我々は、蛍光異方性aの有用性を説明しますタンパク質 – タンパク質相互作用を研究するためのSAツール。定量的情報は、実験データのフィットから得られることができるが、結合は、結合曲線の形状の単純な検査によって評価することができます。