अनुभवजंय, Metagenomic, और गणना तकनीक तंत्र जो द्वारा कवक समझौता मधुमक्खी स्वास्थ्य रोशन
Summary
bumble मधुमक्खी पित्ती समृद्ध और मधुमक्खी लार्वा के लिए पराग की रक्षा के भीतर माइक्रोबियल consortia । अगली पीढ़ी sequencing का उपयोग करना, प्रयोगशाला और क्षेत्र के साथ-प्रयोगों पर आधारित, इस पांडुलिपि का वर्णन प्रोटोकॉल की परिकल्पना है कि फंजीसाइड अवशेषों पराग microbiome, और कॉलोनी जनसांख्यिकी बदल परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया, अंततः कॉलोनी के लिए अग्रणी नुकसान.
Abstract
उत्पादकों अक्सर फंजीसाइड अवशेषों को मधुमक्खियों को उजागर करता है जो रोग के खिलाफ फसलों की रक्षा के लिए खिलने के दौरान फंजीसाइड स्प्रे का उपयोग करें । हालांकि माना जाता है “मधुमक्खी सुरक्षित,” वहां बढ़ते सबूत है कि पराग में फंजीसाइड अवशेषों मधुमक्खी गिरावट के साथ जुड़े रहे है (दोनों शहद और bumble मधुमक्खी प्रजातियों के लिए) । जबकि तंत्र अपेक्षाकृत अज्ञात रहते हैं, शोधकर्ताओं ने अटकलें लगाई है कि मधुमक्खी सूक्ष्म symbioses शामिल हैं । रोगाणुओं संरक्षण और/या पराग, जो लार्वा मधुमक्खियों के लिए पोषण के रूप में कार्य करता है के प्रसंस्करण में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । माइक्रोबियल समुदाय में फेरबदल करके, यह संभावना है कि कवक इन सूक्ष्म मध्यस्थता सेवाओं को बाधित है, और इस तरह मधुमक्खी स्वास्थ्य समझौता । यह पांडुलिपि अप्रत्यक्ष तंत्र (ओं) जिसके द्वारा कवक कॉलोनी गिरावट पैदा हो सकता है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन है । पिंजरा प्रयोगों को उजागर मधुमक्खियों फंजीसाइड-इलाज फूल पहले से ही पहले सबूत है कि कवक एक देशी bumble मधुमक्खी (Bombus impatiens) में गहरा कॉलोनी नुकसान का कारण प्रदान की है । कवक के क्षेत्र-प्रासंगिक खुराक, प्रयोगों की एक श्रृंखला का उपयोग फंजीसाइड उजागर पराग के माइक्रोबियल समुदाय की गतिशीलता का एक बेहतर विवरण प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है । पराग microbiome के भीतर कवक और बैक्टीरियल assemblages की संरचनात्मक संरचना में बदलाव अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और metagenomic विश्लेषण द्वारा जांच कर रहे हैं । प्रयोगों विकसित के साथ साथ कैसे कवक पराग के microbiome-प्रावधानों को प्रभावित एक यंत्रवत समझ प्रदान करने के लिए डिजाइन किया गया है । अंततः, इन निष्कर्षों के माध्यम से जो कवक कॉलोनी गिरावट पैदा हो सकता है अप्रत्यक्ष मार्ग पर प्रकाश डाला जाना चाहिए ।
Introduction
प्रबंधित और जंगली मधुमक्खी प्रजातियों में व्यापक गिरावट का सामना कर रहे हैं, दोनों प्राकृतिक और कृषि प्रणालियों के लिए प्रमुख निहितार्थ के साथ1। इस समस्या के कारणों को समझने के लिए ठोस प्रयासों के बावजूद, हनी मधुमक्खी गिरावट ड्राइविंग कारकों अभी भी अच्छी तरह से2,3,4समझ में नहीं आ रहे हैं । जंगली, देशी मधुमक्खियों की कुछ प्रजातियों के लिए, स्थिति गंभीर5,6बन गया है । यदि मधुमक्खी की आबादी तब तक कायम नहीं रह सकती जब वे औद्योगिक कृषि के साथ काटना, उनकी आबादी में गिरावट जारी रहेगी, और परागण (दुनिया भर में उत्पादन7के ३५%) की आवश्यकता वाली फसलें कम फसल सहना होंगी ।
जबकि कई संभावित कारकों जैसे कीटनाशक जोखिम, रोग, और पर्यावास हानि1,4,8,9,10 शहद मधुमक्खी गिरावट में फंसाया गया है, अपेक्षाकृत कम देशी मधुमक्खियों का स्वास्थ्य पर इन तनावों के इंटरैक्टिव प्रभाव के बारे में जाना जाता है, भीतर या कृषि प्रणालियों के पास । कई मौजूदा अनुसंधान के प्रयासों को कीटनाशकों पर ध्यान केंद्रित जारी है, (उदा, neonicotinoids11,12), हालांकि पिछले अनुसंधान इंगित करता है कि कवक भी स्मृति गठन बिगड़ने से मधुमक्खी गिरावट में एक भूमिका निभा सकता है, घ्राण रिसेप्शन13, नेस्ट मान्यता14, एंजाइम गतिविधि और चयापचय कार्य15,16,17. विश्व स्तर पर, कवक खिलने के दौरान फूलों की फसलों के लिए लागू किया जाना जारी है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मधुमक्खियों आमतौर पर हाइव18फंजीसाइड अवशेषों को वापस लाने के लिए, वास्तव में, अध्ययन के एक बड़े अनुपात का परीक्षण किया पित्ती फंजीसाइड अवशेषों निहित19,20दिखाया गया है । आगे काम से पता चला है कि फंजीसाइड अवशेषों हनी मधुमक्खी लार्वा मृत्यु दर21,22,23 की उच्च दर के साथ जुड़ा हुआ है और कालोनियों के भीतर “entombed पराग” की उपस्थिति है, जो हालांकि गैर विषैले, माइक्रोबियल गतिविधि से रहित है और पोषण24समझौता किया है । तथ्य यह है कि कवक लंबे समय पर विचार किया गया है “मधुमक्खी सुरक्षित,” अब सबूत है कि फंजीसाइड अकेले जोखिम एक देशी bumble मधुमक्खी प्रजातियों में गंभीर कॉलोनी घाटा पैदा कर सकता है के बावजूद, Bombus impatiens25।
फंजीसाइड जोखिम और कॉलोनी मृत्यु दर के बीच करणीय स्थापित करने के लिए, इन रसायनों के ढंग ढंग निर्धारित करने की आवश्यकता है । मिट्टी में सबूत के रूप में26, तलछट27, और जलीय वातावरण28, कवक को लक्षित करके, सबसे अधिक होने की संभावना कवक बहुतायत और पराग के भीतर विविधता-प्रावधानों को बदलने, जिससे एक प्रमुख समुदाय बदलाव लागू है कि दृढ़ता से बैक्टीरिया एहसान कर सकते हैं । कवक प्रतियोगियों या विरोधी के बिना, कुछ रोगजनक बैक्टीरिया अपेक्षाकृत अनियंत्रित पैदा कर सकते हैं, पराग प्रावधानों के बिगाड़ने की सुविधा । पिछले अनुसंधान का प्रदर्शन किया है कि सूक्ष्मजीवों, विशेष रूप से खमीर और रेशा कवक, मधुमक्खियों के लिए पोषण symbionts के रूप में सेवा29,30,31, परजीवी और रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा३२ ,३३, और पराग भंडार की लंबी अवधि के संरक्षण प्रदान करते हैं । कवक, इसलिए, अप्रत्यक्ष रूप से यह सेवाएं प्रदान करने के लिए और/या अवसरवादी रोगजनकों के लिए संवेदनशीलता को बढ़ाने के द्वारा की जरूरत है कि माइक्रोबियल समुदाय को बाधित करने से अपरिपक्व मधुमक्खियों को नुकसान हो सकता है और12परजीवी । खाद्य उत्पादन पर बढ़ती मांगों के साथ, दुनिया भर में फसलों के खिलने के दौरान कवक के साथ हर साल छिड़काव किया जा रहा है, ऐसे फंजीसाइड प्रेरित प्रभाव की भयावहता को समझने की जरूरत है ।
करने की तारीख, प्राथमिक ज्ञान देशी मधुमक्खी माइक्रोबियल पारिस्थितिकी से संबंधित अंतराल निंनलिखित प्रश्नों के द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा सकता है: किस हद तक फंजीसाइड मधुमक्खी पराग प्रावधानों के भीतर माइक्रोबियल समुदाय परिवर्तन करता है? एक बहुत ही बदल माइक्रोबियल समुदाय के साथ खपत पराग के बहाव के प्रभावों क्या हैं? इन पारिस्थितिकी मुनासिब सवालों के साथ ध्यान में रखते हुए, प्रयोगों 1 खुलासा के प्राथमिक लक्ष्यों के साथ विकसित किया गया था) कि फंजीसाइड अवशेषों अकेले एक देशी मधुमक्खी प्रजातियों में गंभीर कॉलोनी गिरावट का कारण बन सकता है; 2) की डिग्री है जो पराग प्रावधानों में माइक्रोबियल समुदायों को कवक द्वारा बदल रहे हैं, और 3) कैसे मधुमक्खी स्वास्थ्य एक गंभीर रूप से बदल माइक्रोबियल समुदाय से प्रभावित है । प्रायोगिक उद्देश्यों के लिए उपर्युक्त प्रश्नों का पता प्रयोगशाला के संयोजन और क्षेत्र आधारित प्रयोगों का उपयोग परिभाषित किया गया । राज्य के-the-कला metagenomic और क्षेत्र अवलोकन के पारंपरिक तरीकों के साथ आणविक तकनीक का प्रयोग, इस शोध के लिए एक साथ मधुमक्खी के स्वास्थ्य पर कवक के संभावित प्रभाव टुकड़ा करना है ।
इस अध्ययन का पहला उद्देश्य है कि फंजीसाइड जोखिम अकेले देशी मधुमक्खी प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण कॉलोनी नुकसान का कारण बन सकता है प्रदर्शित करने के लिए है । एक बड़े क्षेत्र पिंजरों को शामिल अध्ययन के लिए Bombus impatiens, एक सर्वव्यापी, अमेरिका में प्रचुर मात्रा में देशी मधुमक्खी (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3) के कॉलोनी विकास पर फंजीसाइड जोखिम के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह कल्पना की थी कि फंजीसाइड-इलाज पित्ती कम फिटनेस मौजूद है, और गैर उजागर पित्ती की तुलना में असामान्य जनसांख्यिकी । इस प्रयोग से प्राप्त डेटा इस परिकल्पना का समर्थन किया, कि पराग के भीतर फंजीसाइड अवशेषों का प्रदर्शन एक देशी bumble मधुमक्खी प्रजातियों में गहरा कॉलोनी घाटे का एकमात्र कारण25हो सकता है । इस अध्ययन का दूसरा उद्देश्य पराग microbiome के फंजीसाइड एक्सपोजर की प्रतिक्रिया की जाँच करना है. यह कल्पना की है कि पराग के भीतर रोगाणुओं के समुदाय संरचना-कवक को उजागर प्रावधानों अनुपचारित पराग से अलग हो जाएगा । जबकि कवक बहुतायत और विविधता के लिए काफी गिरावट की उंमीद कर रहे हैं, बैक्टीरिया और/या एक प्रमुख कवक प्रजातियों की संभावना अंय प्रतिस्पर्धा कवक के अभाव में अनियंत्रित हो जाना होगा । इन -vivo परीक्षणों की एक श्रृंखला के माध्यम से, माइक्रोबियल समुदाय संरचना में इन पारियों metagenomics का उपयोग कर विश्लेषण किया जाएगा ।
Protocol
1. bumble मधुमक्खी कॉलोनी पर फंजीसाइड एक्सपोजर के प्रभाव की जांच फील्ड पिंजरे प्रयोगों का उपयोग सफलता एक जई के साथ लगाए मैदान में दस जाल पिंजरों की स्थापना की । प्रत्येक पिंजरे के चारों ओर एक खाई खोदन…
Representative Results
Discussion
मधुमक्खी के स्वास्थ्य पर कवक के प्रभाव में जांच कीट प्रबंधन रणनीतियों के एक अध्ययन पहलू बनी हुई है । हमारे अध्ययन का उद्देश्य है कि स्पष्ट रूप से संभावित मधुमक्खी गिरावटें ड्राइविंग कारकों को अलग पूर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक (ओं) के साथ तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए प्रवर्धन और अनुक्रमण सुविधाओं और सेवाओं, केटलीन कार्लसन, जेनिफर आदत, जेक ओटो, और अधिकतम हास प्रदान करने के लिए विस्कॉंसिन जैव प्रौद्योगिकी केंद्र डीएनए अनुक्रमण सुविधा के विश्वविद्यालय का धंयवाद आणविक विश्लेषण । यह काम USDA-कृषि अनुसंधान सेवा विनियोजित कोष द्वारा समर्थित (वर्तमान अनुसंधान सूचना प्रणाली #3655-21220-001) था । इसके अतिरिक्त समर्थन राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा प्रदान किया गया (अनुदान सं. देब-१४४२१४८), डो ग्रेट झीलों ऊर्जा अनुसंधान केंद्र (विज्ञान के डो कार्यालय मांक DE-FC02-07ER64494), और USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान (हैच परियोजना १००३२५८) । C.T.H. जैव चिकित्सा विज्ञान में एक बेंच विद्वान और एक अल्फ्रेड Toepfer संकाय साथी, बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट और अलेक्जेंडर वॉन पीरु फाउंडेशन, क्रमशः द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Natupol Beehive | Koppert | USRESM1 | 16 hives |
| Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
| Abound | Syngenta | 4033540 | Azoxystrobin 22.9% |
| Chlorothalonil | Syngenta | 3452 | Fungicide used for trials |
| Pollen granules | Bee rescued | B004D5650C | 3X 16oz bottles, pollen for trials |
| Bacterial strains for inoculation | Currie Lab | ||
| Yeast strains for inoculation | Hittinger lab | ||
| Primer pairs | UW Biotech Center | ||
| DNA Isolation Kit | Mo Bio | 12830-50 | Commercial DNA isolation kit |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification tool |
| Select Master Mix for CFX | Thermo Fisher | 4472952 | Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye. |
| Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855196 | Instrument used for PCR amplification |
| PCR Clean-Up Kit, | Axygen | 10159-696 | Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes |
| DNA 1000 Kit | Agilent | 5067-1504 | Used for sizing and analysis of DNA fragments |
| MiSeq Sequencer | Illumina | Used for next-generation sequencing | |
| Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) | VWR |
Referências
- Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
- Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, S80-S95 (2010).
- Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
- Vanbergen, A. J. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
- Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
- Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines?. Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
- Klein, A. -. M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
- Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? – A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
- Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
- Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
- Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
- Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
- Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
- Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
- Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
- Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
- Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
- David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
- Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
- Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
- van Engelsdorp, D., et al. “Entombed Pollen”: A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
- Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
- Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
- Huang, C. -. Y., Ho, C. -. H., Lin, C. -. J., Lo, C. -. C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
- Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
- Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
- Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
- Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
- Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
- Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency?. Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
- User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf (2010)
- Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
- Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
- White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , (2015).
- Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
- Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
- Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
- Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
- Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
- Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
- Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
- Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
- Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals?. Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).
