JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Published: September 17, 2016
doi:
10.3791/54586
,
1Institute for Molecular Plant Sciences,University of Edinburgh

Summary

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Abstract

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.

Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Introduction

De meeste levende organismen hebben een endogene tijdwaarnemer efficiënte onderhandelingen over de dagelijkse veranderingen in de omgeving te helpen. Dit tijdwaarnemer, de circadiane klok, reguleert vele aspecten van het metabolisme en fysiologie van een organisme voorspelbare veranderingen in de externe omgeving te anticiperen. In planten bijvoorbeeld, vooruitlopend op tijdelijk voorspelbare pathogeen of herbivoor aanvallen vermindert sterk de algehele gevoeligheid 1-4. Zetmeel metabolisme wordt strak gereguleerd door de circadiane klok van vorig ervoor te zorgen dat zetmeel reserves tot het ochtendgloren of geteeld op lange of korte dag omstandigheden 5. Inderdaad, planten met circadiane klok die overeenkomen met de 24 hr milieu tonen verhoogde groeipercentages, koolstofbevestiging tarieven en overleving in vergelijking met planten runnen van een klok van mismatched periode van 6. De uitgebreide invloed van circadiane ritmes in al deze processen ontstaat grotendeels uit de ritmische regeling tot een derdevan de totale transcriptoom in Arabidopsis 7. Deze ritmische genproducten zijn betrokken bij een breed scala aan cellulaire processen waaronder metabole pathways, hormoon signalering en stressreacties 7. Op de top van dat, is de directe circadiane regulatie van eiwitfunctie vastgesteld bij circadiane regulatie van fosforylering 8 en waarschijnlijk andere post-translationele modificaties (PTMs).

In het centrum van de circadiane klok die deze dagelijkse transcriptie herprogrammering drijft ligt een netwerk van transcriptionele / translationele feedback loops (TTFLs), met inbegrip van de ochtend uitgedrukte genen circadiane klok ASSOCIATED 1 (CCA1) pt LATE VERLENGDE hypocotyl (LHY), die de expressie onderdrukken van de avond genen TIMING vAN CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) en de leden van de avond complex (EG); LUX ARRHYTHMO (LUX), vroegbloeiende 3 (ELF3) pt ELF4 9-11. samen with de pseudo REACTIE REGELAAR-genen (PRR3, 5, 7 en 9), TOC1 onderdrukt CCA1 / LHY expressie, terwijl de EG fungeert als een positieve regulator 12-14. Extra naar terugkoppelingsmechanismen, post-transcriptionele en post-translationele regulering van de TTFL netwerkcomponenten speelt een belangrijke rol bij het afstemmen circadiane ritmes. Tot op heden de meest voorkomende PTM geïdentificeerd op circadiane klok eiwitten fosforylatie 15. De fosforylatie van CCA1 door Caseïne kinase 2 (CK2) beïnvloedt de binding aan promoters 16 gericht en is belangrijk voor temperatuurcompensatie van de circadiane klok 17. De PRR eiwitten worden gefosforyleerd differentieel over de circadiane cyclus, en fosforylering van TOC1 invloed op de interactie met zijn negatieve regulator, de avond gefaseerde klok component Zeitlupe (ZTL) 18. Deze voorbeelden illustreren hoe PTMs en eiwit-eiwit interacties tunen van de TTFL netwerk in een 24-uurstranscriptionele oscillator. Voor een nadere kennismaking met de transcriptie klok netwerk en de regulering, uitstekende recente beoordelingen beschikbaar zijn (bv referentie 15).

Wat echter nog minder duidelijk is welke mate ritmisch gereguleerde processen en andere aspecten van cellulair metabolisme feedback voor de tijdwaarneming mechanisme zelf. Uitgebreide screening van Arabidopsis mutanten klok defecten kan verder begrip van welke mechanismen of signaal transductie in de generatie van 24 uur ritmes kunnen worden betrokken uit een TTFL netwerk. Daartoe Kim en Somers eerder gepubliceerde een doorbraak werkwijze voor de efficiënte en snelle analyse van klokfunctie enkele Arabidopsis lijn 19. Gebaseerd op het gebruik van tijdelijke expressie in protoplasten, overtreft deze methode de behoefte aan stabiele transgene lijnen of kruist luminescerende klok marker lijnen. Hier, visualiseren we een hoge opbrengst protoplast isolation methode 20 in combinatie met een geoptimaliseerd protocol circadiane gebreken door luminescerende beeldvorming van transiënt tot expressie klok markers screenen in een 96-well plaatlezer.

We zullen vergelijken wild-type Samen- 0 Arabidopsis om goed gekarakteriseerd klok mutanten aan de hier beschreven met succes detecteert veranderde circadiaanse ritmes methodologie te bevestigen. Protoplasten afgeleid van deze lijnen worden getransfecteerd met een reporter construct dat vuurvliegluciferase van de circadiane CCA1 promotor uitdrukt; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalyseert de meerstaps reactie waarbij luciferine wordt omgezet in elektronische geëxciteerde oxyluciferin dat licht uitzendt 21, die is afgebeeld in de tijd om de periode, amplitude en fase van transcriptionele ritmes in deze protoplasten beoordelen.

Het protocol bestaat uit drie grote delen; isoleren van de protoplasten, transfecteren van de protoplasten met het reporterplasmide, en luminescerend imveroudering. Deze drie onderdelen moeten altijd worden uitgevoerd op een enkele dag, met vers bereide buffers en reagentia. Plantengroei en zuivering van voldoende hoeveelheden reporterplasmide moet worden uitgevoerd op voorhand en zijn niet zichtbaar in dit protocol.

Protocol

LET OP: In dit protocol worden reagentia en volumes beschreven uitgedrukt per Arabidopsis lijn die wordt getest, en zal resulteren in zes repliceren putten voor die genotype. Vermenigvuldig het materiaal met het aantal regels te analyseren bij het analyseren van meerdere regels. In de video, zal wildtype Arabidopsis worden vergeleken met de circadiane klok mutantlijn ZTL (hoewel representatieve resultaten van andere lijnen later worden verstrekt). enzymoplossing cellulase 0,5% (w / v) pectinase R10 0,25% (w / v) D-mannitol 400 mM CaCl2 10 mM KCl 20 mM Runderserumalbumine 0,1% (w / v) MES, pH 5,7 20 mM W5-oplossing NaCl 150 mM CaCl2 125 mM KCl 5 mM MES, pH 5,7 2 mM Glucose 5 mM MMG oplossing MES, pH 5,7 4 mM D-mannitol 400 mM MgCl2 15 mM PEG-oplossing PEG4000 40% (w / v) D-mannitol 200 mM CaCl2 </td> 100 mM Imaging oplossing W5-oplossing eindvolume Foetaal runderserum 5% (v / v) luciferine 1,2 mM ampicilline 50 mg / ml Tabel 1: Lijst van oplossingen. 1. Voorbereiding van Materialen en Buffers Plant Materialen Houd Arabidopsis Col -0 zaden in water in een 1,5 ml buis bij 4 ° C in het donker gedurende vier dagen. Pipetteer de zaden op aarde in een pot overgebracht, staan ​​omstandigheden (16 uur licht 8 uur donker) bij 21 ° C gedurende 7 dagen. Laat een deksel op de pot voor de eerste drie dagen hoge vochtigheidsgraad waarborgen. Transplant zes zaailingen in nieuw 8 cm x 13 cm x 5 cm pot en verder groeien van de planten onder dezelfde voorwaarden another 21 dagen. Zorg ervoor dat de bodem is vochtig overal. Reporter Plasmid Zuiver het CCA1pro: LUC reporterplasmide 19 van bacteriekweek vooraf, met behulp van een DNA isolatie kit volgens instructies van de fabrikant. OPMERKING: 20 ug reporterplasmide vereist (10 gl bij 2 ug / ul in dH 2 O) voor transfectie. Oplossingen OPMERKING: Hiervoor protocol vijf oplossingen nodig: enzymoplossing, Wash oplossing 5 (W5) oplossing, Mannitol-Magnesium (MMG), polyethyleenglycol (PEG) oplossing en imaging oplossing (Tabel 1). Bereid deze voordat u doorgaat naar de protoplastisolatie stap. Bereid 10 ml enzymoplossing volgens Tabel 1, het toevoegen van de enzymen laatste en filter steriliseren van de oplossing door een 0,22 urn spuitfilter. Bereid de resterende oplossingen in de volgende volumes: 15 ml W5-oplossing, 10 ml MMG sPLOSSING, 1 ml PEG-oplossing en 1,5 ml weergaveoplossing volgens tabel 1. Opmerking: Het is belangrijk dat de PEG-oplossing niet minder bereid dan een uur voor de transfectie zodat de PEG volledig is opgelost. Filter steriliseren de imaging oplossing door een 0,22 pm spuitfilter. Figuur 1:. Protoplastisolatie De bladeren van volwassen Arabidopsis planten (A) zijn bevestigd op autoclaventape met de lagere epidermale lagen naar boven (B). (C) Magic tape voorzichtig op de onderste epidermale laag met de punt van een 15 ml conische buis gedrukt. (D) De magic tape wordt verwijderd om de mesofylcellen (E) bloot. (F) Stroken autoclaaf tape met verlofs bevestigd worden geïntroduceerd op enzymoplossing die cellulase en pectinase, vrijgeven protoplasten in de oplossing. (G) De bladskeletten blijven autoclaventape na enzymdigestie worden verwijderd, waardoor de protoplasten enzymoplossing (H). (I) Final resulteert bladmoes protoplasten (Schaal bar = 50 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. protoplastisola- Label een petrischaaltje en voeg 10 ml-filter gesteriliseerd Enzyme oplossing. Fix vier stroken autoclaventape met de klevende zijde naar boven op een schone laboratorium oppervlak en merk van de grootte van de petrischaal op de stroken. Snijd de bladeren van 4 weken oude planten (figuur 1a), en druk op de bovenste epidermis op de autoclaaf tape (dwz de ondergrens huidoppervlak naar boven ( <strong> Figuur 1b)). Druk voorzichtig op strips van magie tape op het onderste epidermale oppervlak met behulp van een 15 ml conische buis. Zorg ervoor dat u het blad weefsel (figuur 1c) verpletteren. Trek de magie tape af naar de onderste epidermis strip (figuur 1d) en bloot de bladmoes cellen (Figuur 1e). Snijd de autoclaaf tape om de petrischaal te passen, gebruik een pincet om de band te verplaatsen naar de petrischaal en drijven op het enzym-oplossing (figuur 1f), laat naar beneden. Draaien met 60 rpm op een platform schudmachine gedurende 60 minuten, waarbij de protoplasten wordt vrijgemaakt in de oplossing. Met een pincet aan de oplossing bevattende de protoplasten (figuur 1H) in een 50 ml conische buis Verwijder de stroken autoclaventape (figuur 1G) en pipet. Gebruik een breed-boring pipetpunt (zoals een P5000 tip of een P1000 tip met het einde afgesneden). Centrifugeer de protoplasten bij 100 xg gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Wees voorzichtig, omdat de pellet is erg los. Voeg 10 ml W5 oplossing voor de protoplasten en resuspendeer onder voorzichtig schudden de buis. Rest de protoplasten op ijs gedurende 30-60 min. Tijdens deze stap beoordeelt opbrengst van protoplasten te tellen in een hemocytometer (Figuur 1i). Verzamel de protoplasten door centrifugatie bij 100 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Wees voorzichtig, omdat de pellet is erg los. Resuspendeer de protoplasten tot een concentratie van 5 x 10 5 protoplasten / ml in MMG oplossing. 3. Protoplast Transfectie Voeg 10 ul reporterplasmide (2 ug / ul) in een 15 ml conische buis. Voeg 400 ul protoplasten aan de buis. Voeg een volume (410 pl) PEG-oplossing en meng door het buisje voorzichtig 12 keer tot de protoplasten transfecteren. Na 8-15 min incubation bij kamertemperatuur, de protoplast-DNA-PEG mengsel met vier volumina (1640 ui) W5-oplossing en meng door voorzichtig zes keer. Verzamel de getransfecteerde protoplasten door centrifugatie bij 100 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Nogmaals, zorg, zoals de pellet is erg los. Resuspendeer de protoplasten in 1250 pl weergaveoplossing. Aliquot 200 ul in zes repliceren putjes van een 96-well plaat, vul alle lege putten met W5-oplossing, en sluit de plaat met een kleefmiddel duidelijke deksel geschikt voor lichtgevende beeldvorming. 4. Imaging Breng de plaat aan een lichtgevende beeldvorming setup geschikt voor installatie beeldvorming. Verander het kleefmiddel deksels op de platen 10-15 min na overdracht naar condensatie en drukverschillen tussen de putjes te voorkomen, start beeldvorming. Lees de plaat elk ~ 45 min (3 sec per putje) gedurende vijf dagen bij kamertemperatuur. Merk opfrequentie van de plaat leest en de leestijd per goed zou kunnen variëren afhankelijk van de beeldvorming setup. 5. Data Analysis Analyseer de luminescentie resultaten met behulp van een analysesoftware (bijvoorbeeld biologische ritmes Analysis Software System (messing) 22). Vergelijk de mutant lijn naar wild-type controles om circadiane gebreken onthullen.

Representative Results

Protoplasten van wild-type Arabidopsis werden vergeleken met de bekende klok mutanten cca1 / Lhy (korte periode mutant 2), ZTL (lange periode mutant 23), en de overexpressie lijn CCA1 -Ox (aritmische 24). Allen werden tijdelijk met de CCA1pro: LUC reporter en afgebeeld in constant licht op een bord lezer over 5 dagen. Hier laten we zien dat in de cca1 / Lhy mutant, de free-running periode van circadiane-gecontroleerde genexpressie wordt verkort (figuur 2a), in lijn met de gepubliceerde periode van stabiele transgene expressie van lichtgevende klok markers 2,9 geanalyseerd. De periode van circadiane oscillaties in protoplasten van de ZTL mutant langer dan in wildtype (figuur 2b), in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten van zaailingen, celsuspensie cultures en protoplasten 19,23,25. Overexpressie van CCA1 sloten de klok in de ochtend-fase en mondiale transcriptie wordt aritmische 24. Consequent, zagen we geen oscillaties in CCA1pro: LUC expressie in CCA1 -Ox protoplasten (figuur 2c). Figuur 2: Protoplast circadiaanse ritmes Protoplasten van Samen- 0, cca1 / Lhy, ZTL en CCA1 -Ox werden tijdelijk getransformeerd met de CCA1pro: LUC construct en circadiane ritmen bij luminescentie werden afgebeeld over 5 dagen (A – C). (D) circadiane periode schattingen op basis van luminescentie sporen in Col -0, cca1 / Lhy en ZTL (A – B). Meeen ± SEM, n = 3-5, t-test p-waarde zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Genotype Periode (protoplasten) Periode (transgene) Aangegeven door: Referenties collega 0 23,0 ± 0,21 24,4 ± 0,09 pCCA1: LUC in Col -0 (2) cca1 / Lhy 20,6 ± 0,13 19,9 ± 0,11 pCCA1: LUC in Col -0 (2) ~ 18 RNA in L ER achtergrond (9) <td> ZTL 25,1 ± 0,12 27,4 ± 0,5 CAB2: LUC in C24 ecotype (22) CCA1 -Ox aritmische aritmische pCCA1: LUC (LD alleen gegevens) (2) aritmische RNA en eiwit in Col -0 achtergrond (23) Tabel 2: circadiane ritmes in protoplasten vergelijking met Transgene Zaailingen de circadiane periode pCCA1. LUC expressie in protoplasten opzichte van de periodelengten eerst gemeld voor de mutatie en, indien beschikbaar, met pCCA1: LUC expressie in Col -0.

Discussion

Hier presenteren we een snelle bepaling om circadiane periode gebreken in Arabidopsis-lijnen, zoals protoplastisolatie, transfectie en luminecent afbeeldscherm. De circadiane periode in de wild-type Arabidopsis en de klok mutanten cca1 / Lhy, ZTL en CCA1 -Ox werd berekend uit metingen van luminescentie uit een CCA1pro: LUC reporter en vond in overeenstemming met gepubliceerde gegevens gegenereerd op basis van hele planten met behulp van meer tijd- te zijn consumeren transgene benaderingen (tabel 2). Met behulp van deze test om Arabidopsis mutanten screenen vermijdt de eerste vereiste om transgene lijnen luminescerende genereren, wat tijdrovend en kan alleen bekend dat er een bepaalde mutant vertoont wildtype ritmes. Een duidelijk voordeel van dit protocol is dat elke Arabidopsis lijn kan worden gescreend in korte tijd veranderde circadiane transcriptie ritmes, die de identificatie van meer genen die van invloed tijdwaarneming in planten zal helpen.

<p class= "Jove_content"> Isolatie van protoplasten kan omslachtig zijn, vooral als de mutant regel geeft een verkleinde fenotype. Eerder gemeld methoden voor het genereren van protoplasten betrekken snijden bladeren of zaailingen in dunne reepjes en vacuüm infiltreren in de strips met enzymoplossing zodat de enzymen om de celwanden 26,27 bereiken. De daaropvolgende digestie vereist ten minste 3 uur incubatie in het donker naar de protoplasten introductie in de enzymoplossing. Wanneer vacuüm infiltratie niet wordt toegepast, wordt incubatietijd tot 18 uur geadviseerd. In de hier gepresenteerde protocol, vacuüm infiltratie niet nodig omdat de epidermale cellaag ondoordringbaar voor de enzymen wordt verwijderd door de tape. Bij het genereren van protoplasten door snijden plantaardig materiaal moet worden gescheiden van protoplasten celwand puin na digestie; Dit wordt meestal gedaan door het filteren van de oplossing of het zuiveren van het op een helling suiker 27,26. Hier vindt elke onverteerd weefsel op de autoclaaf tape na blijvenspijsvertering, zodat filtratie en suiker gradiënt zuivering van de protoplasten kan worden weggelaten. Er is een kans dat de stress als gevolg van langdurige protoplasting procedures beïnvloedt levensvatbaarheid van de cellen en de circadiane klok. De tape-gebaseerde protoplasting methode 20 hier gevisualiseerd levert een groot aantal protoplasten; en gezien de levensvatbaarheid van cellen over een circadiane tijdreeks en de bijbehorende periodelengten protoplasten en gehele zaailingen (tabel 2), is de hier beschreven werkwijze de voorkeur boven andere methoden om protoplasten te genereren.

De transfectie stap van het protocol is een cruciale stap dat de gevolgen voor de levensvatbaarheid van de protoplasten. De PEG-oplossing maakt het DNA te leveren in de cel, en beide incubatietijd in deze oplossing (stap 3,4) en het percentage van PEG moet empirisch worden bepaald. De standaardconcentratie is 20%, met lagere concentraties verminderen de transformatie-efficiëntie en hogereconcentraties verlagen de levensvatbaarheid 28. Incubatietijd zo kort vijf minuut efficiënte transfectie van de protoplasten 27 werd verkregen.

De protoplasten kan worden afgebeeld op een luminescerend imaging platform. In deze video, hebben we een luminescentie plaatlezer uitgerust met externe verlichting gebruikt (rode en blauwe LED's 630 en 470 nm, respectievelijk, op een gecombineerde intensiteit van ~ 20 uE), die zorgt voor hoge doorvoer screening en frequente metingen. Andere beeldapparatuur die luminescentie gedetecteerd, zoals alternatieve plaatlezers of opstellingen rond een ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera, zou evengoed worden toegepast zolang verlichting beschikbaar is voor de fotosynthese. Het voordeel van een CCD camera gemonteerd op een bestuurbare kast wordt licht en temperatuur kunnen worden geprogrammeerd. Een nadeel is de langere opnametijdstip invoering langdurige duisternis die stress kan veroorzaken aan de protoplasten naast verstorening endogene tijdwaarneming. Ongeacht welke experimenteel platform wordt gekozen, aanpassing van instellingen waarschijnlijk noodzakelijk zijn in vergelijking met instellingen voor zaailingen of volgroeide planten. In onze ervaring, het verhogen van de concentraties van reporterplasmide tijdens transfectie en / of luciferine in de beeldvorming buffer kan eventuele onregelmatig of snel dempende ritmes die zich kunnen voordoen in de eerste experimenten op te lossen.

In toekomstige experimenten, kan de hier beschreven methode worden toegepast om de circadiaanse fenotype van elke mutant Arabidopsis lijn bestuderen. Met kleine aanpassingen, kan het effect van bijvoorbeeld verschillende geneesmiddelen op tijdwaarneming worden bestudeerd in deze opstelling. Bovendien kan de transfectie worden gewijzigd om kunstmatige microRNA voor gen-silencing 19 omvatten verder uitbreiden van de veelzijdigheid van dit protocol. Protocollen bij rijstprotoplasten genereren zijn gerenommeerde 29 en de imaging protocol hier gepresenteerde kan evengoed worden toegepast op onze u verdernderstanding van de klok in economisch belangrijke monocotyle gewasplanten.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

Materials

CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore 219466
Pectinase R10 Sigma Aldrich P2401
D-mannitol Sigma Aldrich M4125 
CaCl2 Sigma Aldrich C4901
KCl Sigma Aldrich P3911
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4503
MES Acros Organics 327765000
NaCl Acros Organics 327300010
Glucose Fischer Scientific G/0500/60
MgCl2 Sigma Aldrich M2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000 Acros Organics 434630010
Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich F4135
D-Luciferin, Firefly Biosynth AG L-8200 Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM
Ampicillin Sigma Aldrich A9618
Comply Steam Indicator Tape 3M 1222
Magic Tape 3M 819-1460
Petri Dishes Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, white Greiner Bio-One 655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates Perkin Elmer 6050195
Syringe, 10 ml, w/o needle BD Plastipak 302188
Syringe filter 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) Free download at amillar.org
QIAfilter Maxiprep Kit Qiagen 12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell Hawksley AC6000
Bright field microscope Optika Microscopes B-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module Berthold Technologies Ltd 57947/57948
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
  2. Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).
  3. Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
  4. Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
  5. Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
  6. Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
  7. Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).
  8. Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
  9. Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
  10. Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
  11. Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
  12. Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
  13. Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
  14. Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
  15. Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
  16. Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
  17. Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).
  18. Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
  19. Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
  20. Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16 (2009).
  21. Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
  22. Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).
  23. Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
  24. Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
  25. Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
  26. Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
  27. Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  28. Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
  29. Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).

Tags

ArabidopsisProtoplastsCircadianLuminescentReporterCircadian PeriodCircadian BiologyGene FeedbackTransgenicEnzyme SolutionEpidermisMesophyll CellsW5 SolutionHemocytometerMMg Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image