تحليل سريع من الظواهر الإيقاعية في نبات الأرابيدوبسيس جبلة مجردة Transfected مع ساعة مراسل الفلورسنت
Summary
تنظم الساعة اليومية عن ثلث Transcriptome على نبات الأرابيدوبسيس، لكن نسبة الجينات التي تغذي مرة أخرى إلى ضبط الوقت ما زال مجهولا. نحن هنا تصور طريقة لتقييم بسرعة الظواهر الإيقاعية في أي خط متحولة من نبات الأرابيدوبسيس باستخدام التصوير الانارة مراسل الإيقاعية أعرب عابر في جبلة مجردة.
Abstract
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
Introduction
معظم الكائنات الحية تمتلك وناظما الذاتية لمساعدة التفاوض الفعال من التغيرات اليومية في البيئة. هذا ناظما، على مدار الساعة الساعة البيولوجية، وينظم العديد من جوانب عملية التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء من كائن حي الى توقع التغيرات يمكن التنبؤ بها في البيئة الخارجية. في النباتات على سبيل المثال، تحسبا لوقوع هجمات الممرض أو عاشب يمكن التنبؤ بها مؤقتا يقلل بقوة قابلية الشاملة 1-4. وينظم عملية الأيض النشا بإحكام قبل الساعة اليومية لضمان أن احتياطيات النشا تستمر حتى الفجر سواء نمت في طويلة أو قصيرة الظروف اليوم 5. في الواقع، والنباتات مع الساعات الإيقاعية مطابقة المعرض بيئة زيادة معدلات النمو مدار 24 ساعة، ومعدلات تثبيت الكربون ومعدلات البقاء على قيد الحياة مقارنة مع محطات تشغيل على مدار الساعة لفترة غير متطابقة 6. تأثير واسع النطاق من ايقاعات كل يوم في جميع هذه العمليات يطرح نفسه إلى حد كبير من التنظيم الإيقاعي لمدة تصل إلى الثلثمن Transcriptome على الكلي في نبات الأرابيدوبسيس 7. وتشارك هذه المنتجات الجينات الإيقاعية في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية بما في ذلك مسارات التمثيل الغذائي، وهرمون الإشارات، واستجابات التوتر 7. وعلاوة على ذلك، يتم تأسيس تنظيم الساعة البيولوجية المباشر من وظيفة البروتين عن طريق تنظيم الساعة البيولوجية من الفسفرة 8 وغيرها من التعديلات بعد متعدية على الأرجح (PTMs).
في وسط الساعة اليومية التي تحرك هذا برمجة النسخي اليومية يكمن شبكة من النسخي / ردود الفعل متعدية حلقات (TTFLs)، بما في ذلك الجينات وأعرب الصباح الساعة البيولوجية CLOCK المرتبطين 1 (CCA1) وأواخر ممدود التحتفلقي (LHY) التي تقمع التعبير من توقيت الجينات مساء CAB 1 (TOC1)، ضخامي (GI) وأعضاء من المجمع مساء (EC)؛ LUX ARRHYTHMO (LUX)، المزهرة في وقت مبكر 3 (ELF3)، وELF4 9-11. الطرافة معاح -genes REGULATOR الزائف استجابة (PRR3 و 5 و 7 و 9)، TOC1 يقمع CCA1 التعبير / LHY في حين تعمل المفوضية الأوروبية كمنظم إيجابي 12-14. الإضافي لآليات التغذية المرتدة، بعد النسخي وبعد متعدية تنظيم مكونات شبكة الاتصال TTFL يلعب دورا هاما في ضبط الإيقاع اليومي. حتى الآن، PTM الأكثر وفرة التعرف على البروتينات الساعة اليومية هو الفسفرة 15. فسفرة CCA1 من الكازين كيناز 2 (CK2) يؤثر ملزمة لاستهداف المروجين 16 و مهم لتعويض درجة الحرارة على مدار الساعة الإيقاعية 17. وفسفرته البروتينات PRR تفاضلي خلال دورة الساعة البيولوجية، والفسفرة من TOC1 يؤثر التفاعل مع منظم السلبي، وZEITLUPE عنصر مدار الساعة على مراحل مساء (ZTL) 18. وتوضح هذه الأمثلة كيف PTMs وتفاعلات البروتين البروتين ضبط شبكة TTFL في-ساعة 24مذبذب النسخي. للحصول على مقدمة أكثر تفصيلا للشبكة على مدار الساعة النسخي ولائحته التنفيذية، واستعراض ممتازة الأخيرة المتاحة (مثل إشارة 15).
ومع ذلك، ما يزال أقل وضوحا هو مدى عمليات ينظم بشكل متوازن وغيرها من جوانب الأيض الخلوي تتغذى مرة أخرى إلى آلية ضبط الوقت نفسه. فحص واسعة من المسوخ نبات الأرابيدوبسيس عن عيوب مدار الساعة ويمكن الحصول على مزيد من الفهم الذي آليات أو مسارات إشارات يمكن أن تشارك في توليد 24 إيقاعات ساعة من شبكة TTFL. تحقيقا لهذه الغاية، كيم وسومرز نشرت سابقا طريقة اختراق للتحليل الفعال والسريع من وظيفة على مدار الساعة في أي خط نبات الأرابيدوبسيس 19. تعتمد على استخدام التعبير عابر في جبلة مجردة، هذه المنهجية تفوق الحاجة لخطوط المعدلة وراثيا مستقرة أو يعبر إلى خطوط مدار الساعة علامة الانارة. هنا، نحن تصور عالية isolatio البروتوبلازم للاستسلامن طريقة 20 جنبا إلى جنب مع بروتوكول الأمثل للكشف العيوب الساعة البيولوجية بواسطة التصوير الانارة من علامات الساعة أعرب عابر في قارئ لوحة 96-جيدا.
سنقارن من النوع البري زملاؤه 0 نبات الأرابيدوبسيس إلى طفرات على مدار الساعة تتميز جيدا لتأكيد منهجية الموصوفة هنا بنجاح بالكشف عن الإيقاعات اليومية المتغيرة. و transfected جبلة مجردة المستمدة من هذه الخطوط مع بناء مراسل التي تعبر عن وسيفيراز اليراع من المروج CCA1 الإيقاعية، CCA1pro: لوك 19. وسيفيراز يحفز رد فعل متعددة الخطوات التي يتم تحويلها إلى وسيفيرين متحمس إلكترونيا oxyluciferin التي تنبعث ضوء 21، الذي التقط مع مرور الوقت لتقييم الفترة، السعة ومرحلة من الإيقاعات النسخي في هذه جبلة مجردة.
يتكون البروتوكول من ثلاثة أجزاء رئيسية. عزل جبلة مجردة، transfecting في جبلة مجردة مع البلازميد مراسل، والتراسل الفوري الانارةشيخوخة. وينبغي دائما أن يتم تنفيذ هذه الأجزاء الثلاثة في يوم واحد، وذلك باستخدام الطازجة المخازن والكواشف. يجب أن يتم تنفيذ نمو النبات وتنقية كميات كافية من البلازميد مراسل مقدما ولا تصور في هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم الفحص السريع للكشف عيوب فترة الإيقاعية في خطوط نبات الأرابيدوبسيس، بما في ذلك عزل البروتوبلازم، ترنسفكأيشن، والتصوير luminecent. فترة الإيقاعية في البرية من نوع نبات الأرابيدوبسيس وعلى مدار الساعة المسوخ cca1 / lhy، ZTL، وكان يحسب CCA1 -OX من القياسات من التألق من CCA1pro: المراسل لوك وجدت لتكون متسقة مع البيانات المنشورة الناتجة من النباتات الكاملة باستخدام أكثر قت- تستهلك النهج المعدلة وراثيا (الجدول 2). استخدام هذا الاختبار لفحص المسوخ نبات الأرابيدوبسيس يتجنب الشرط الأولي لتوليد خطوط الانارة المعدلة وراثيا، والتي تستغرق وقتا طويلا، وربما تكشف إلا أن المسخ بعينه المعارض من النوع البري الإيقاعات. وهناك ميزة واضحة من هذا البروتوكول هو أن أي خط نبات الأرابيدوبسيس يمكن فحص في وقت قصير لإيقاعات الساعة البيولوجية النسخي المتغيرة، الأمر الذي سيساعد على تحديد المزيد من الجينات التي تؤثر على ضبط الوقت في النباتات.
<p class= "jove_content"> عزل جبلة مجردة يمكن أن يكون شاقة، خاصة إذا تعرض خط متحولة النمط الظاهري تتضاءل. أساليب ذكرت سابقا لتوليد جبلة مجردة تشمل قطع الأوراق أو الشتلات إلى شرائح رقيقة وفراغ التسلل إلى قطاع غزة مع حل الانزيم للسماح للأنزيمات لتصل إلى جدران الخلايا 26،27. عملية الهضم لاحق يتطلب على الأقل 3 ساعة حضانة في الظلام للافراج عن جبلة مجردة في حل الانزيم. عندما لا يتم تطبيق تسلل الفراغ، وينصح حضانة زمنية تصل إلى 18 ساعة. في بروتوكول المعروضة هنا، فراغ تسلل غير ضروري لأن إزالة طبقة الخلايا البشرة منيع لالانزيمات التي كتبها الشريط. عند إنشاء جبلة مجردة عن طريق خفض المواد النباتية من الضروري جبلة مجردة منفصلة عن الحطام جدار الخلية بعد الهضم. ويتم ذلك عادة من خلال تصفية حل أو مطهرا إياها على 27،26 السكر التدرج. هنا، سوف يبقى أي نوع من الأنسجة غير المهضومة على الشريط الأوتوكلاف بعدالهضم، لذلك الترشيح والسكر التدرج تنقية جبلة مجردة يمكن حذفها. هناك فرصة أن الإجهاد الناجم عن الإجراءات protoplasting طويلة يؤثر على بقاء الخلية والساعة اليومية. على شريط القائمة على طريقة protoplasting 20 تصور هنا ينتج عددا كبيرا من جبلة مجردة. ونظرا لبقاء الخلايا على سلسلة زمنية الإيقاعية وأطوال فترة المطابقة من جبلة مجردة والشتلات كاملة (الجدول 2)، ويفضل المنهجية الواردة هنا على طرق بديلة لتوليد جبلة مجردة.الخطوة ترنسفكأيشن من البروتوكول هو خطوة حاسمة تؤثر على صلاحية جبلة مجردة. الحل PEG تمكن الحمض النووي ليتم تسليمها إلى داخل الخلية، وكلاهما فترة حضانة في هذا الحل (الخطوة 3.4) ونسبة الربط يجب أن تحدد تجريبيا. التركيز هو معيار 20٪، مع تركيز أقل التقليل من كفاءة التحول وأعلىتركيزات الحد من قابلية 28. فترة حضانة قصيرة بقدر خمس دقائق يمكن أن تسفر ترنسفكأيشن كفاءة من جبلة مجردة 27.
في جبلة مجردة يمكن تصويرها على أي منصة الانارة التصوير. في هذا الفيديو، وقد استخدمنا قارئ لوحة التلألؤ مجهزة أضواء الخارجية (أحمر وأزرق المصابيح، 630 و 470 نانومتر، على التوالي، في شدة مجتمعة ~ 20 μE)، والذي يسمح لفحص عالية الإنتاجية وقياسات متكررة. غيرها من معدات التصوير التي يكشف التلألؤ، مثل القراء لوحة بديلة أو الاجهزة التي تدور حول جهاز (CCD) وكاميرا مزدوجة الشحن، ويمكن تطبيق جيد على قدم المساواة طالما الإضاءة المتاحة لعملية التمثيل الضوئي. وميزة استخدام كاميرا CCD التي شنت على الحكومة السيطرة عليها هي أن الضوء ويمكن برمجتها درجة الحرارة. والعيب هو الوقت التقاط أطول، وإدخال فترات طويلة من الظلام الذي يمكن أن يسبب الضغط على جبلة مجردة بالإضافة إلى التشويشجي ضبط الوقت الذاتية. بغض النظر عن أي منصة التجريبية التي يتم اختيارها، ومن المرجح أن تكون ضرورية بالمقارنة مع إعدادات لشتلات أو النباتات الناضجة تعديل الإعدادات. في تجربتنا، وزيادة تركيز البلازميد مراسل أثناء ترنسفكأيشن و / أو وسيفيرين في المخزن المؤقت التصوير قد حل أي إيقاعات عدم انتظام أو الملطف بسرعة التي قد تحدث في التجارب الأولية.
في التجارب المستقبلية، يمكن تطبيق منهجية الموصوفة هنا لدراسة النمط الظاهري الساعة البيولوجية من أي خط نبات الأرابيدوبسيس متحولة. مع تعديلات طفيفة، وتأثير مختلف انواع المخدرات على سبيل المثال على ضبط الوقت يمكن دراسة في هذا الإعداد. وعلاوة على ذلك، فإن ترنسفكأيشن يمكن تعديلها لتشمل الرنا الميكروي الاصطناعي لجين إسكات 19، زيادة توسيع براعة هذا البروتوكول. و-راسخة بروتوكولات لتوليد جبلة مجردة الأرز (29) وبروتوكول التصوير المقدمة هنا يمكن بنفس القدر أن تطبق لتعزيز موقعنا شnderstanding على مدار الساعة في النباتات ذات الأهمية الاقتصادية للمحاصيل monocot.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
Materials
| CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
| Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics | 327765000 | |
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
| Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
| Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
| Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
| Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
| Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
| QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
| Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
| Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
| LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |
Referências
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
- Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).
- Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
- Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
- Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).
- Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
- Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
- Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
- Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
- Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
- Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
- Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
- Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
- Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
- Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
- Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16 (2009).
- Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
- Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).
- Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
- Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
- Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
- Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).
