HIV-1-replikasjon i målcellen involverer flere trinn, grovt gruppert i to faser: tidlige og sene hendelser. De tidlige begivenheter begynne når HIV-1 i rekkefølge bindes til mål-celleoverflatereseptoren CD4 og en av de to co-reseptorer (CCR5 eller CXCR4) ^1. Følgelig virus-cellemembraner sikring, og det virale kapsid (CA), kjerne frigjøres i cytoplasmaet ^2. CA-kjerne inneholder det virale genomiske enkelt-trådet RNA (ssRNA) og flere proteiner, både virale og cellulær opprinnelse. CA-assosiert virale proteiner inkluderer revers transkriptase (RT) og integrase (IN), to enzymer som formidler viktige skritt i tidlige hendelser i virusreplikasjon. RT og IN funksjon i sammenheng med nukleoprotein komplekser, nemlig revers transkripsjonskompleks (RTC) og pre-integrasjons kompleks (PIC), henholdsvis ^{3, 4, 5} <sup> ^6. Endene av det virale genomet ssRNA havn terminal gjentagelse (R) elementer hosliggende til den unike sekvenser U5 (ved 5'-enden) og U3 (ved 3'-enden). RTC omdanner det virale genomet ssRNA inn i en dobbelt-trådet (ds) DNA-kopi (vDNA). Denne revers transkripsjon prosess resulterer også i duplisering av de U5 og U3-sekvenser, og dermed generere lange terminale gjentagelser (LTR) i begge ender av den vDNA ^{7, 8.} Deretter katalyserer PIC-assosierte IN to sekvensielle biokjemiske reaksjoner som muliggjør integrering av det vDNA i vertskromosomet ^{9, 10, 11.} Først, i cytoplasma, IN multimerer engasjere både LTR ¹² og spalte et dinukleotid fra hver av de 3'-terminale ender. Denne 3'-ende behandlingen genererer en hydroksylgruppe ved hver 3'-ende (CA _OH) av vDNA.Deretter PIC traffics til kjernen, karakterisert v e d IN benytter vDNA CA _OH som en nukleofil for å kutte begge tråder av det kromosomale DNA i en forskjøvet måte. Samtidig IN koordinert skjøter begge ender av vDNA til de resulterende fosfodiesterbindinger på motsatte retninger av det kromosomale DNA. Etter dette strand overføringstrinn, fjerner vertscellen maskiner de to uparede nukleotider på 5 'endene av vDNA og reparasjoner de påfølgende enkelt strandet hull i krysset av integrasjonen nettstedet. De tidlige hendelser dermed kulminere med etablering av et integrert DNA-kopi (provirus) av HIV-1 genomet. Proviruset gir et egnet miljø for effektiv viral genekspresjon, som starter senere begivenheter, inkludert uttrykk for virus-kodet proteiner; Monteringen av umodne virus; og spirende, utgivelsen, og modning i smittsomme viruspartikler ^13.

Renset rekombinant retroviral IN er kompetent til ågjennomføre, in vitro, både 3'-ende prosessering og tråd overføring aktiviteter på eksogent tilførte LTR-lignende substrat DNA. Biokjemiske studier med slik renset rekombinant I har avdekket kritiske aspekter ved vDNA integrasjon ^{14, 15, 16, 17.} Imidlertid, i motsetning til i naturlig infeksjon, betyr dette in vitro biokjemisk reaksjon støtter felles integrasjon av begge ender av substratet DNA i mål-DNA. I motsetning til dette retrovirus PICs isolert fra akutt infiserte celler concertedly integrere begge ender av den endogene vDNA inn i heterologe mål-DNA. Dette førte til utbredt bruk og påfølgende avgrensninger av I n Vitro Integration (IVI) analyser ved hjelp av isolerte innfødte Pics.

I det første rapporterte retrovirale assay IVI, cytoplasmiske ekstrakter fra celler infisert med et rekombinant murintLeukemi virus (MLV) skjuler den E. coli supF-genet i sin LTR tjente som kilde for IN-aktivitet, og DNA av en mutant som er defekt i lambda-fage lytisk vekst ble eksogent tilført som det mål-DNA. Vellykket integrering av det rekombinante DNA-MLV kopiere, i den fag-DNA og den påfølgende supF uttrykket førte til gjenopprettelse av den plakk-dannende egenskaper av de rekombinante fager. Imidlertid er denne forsøks strategien arbeidskrevende og tiltak for integrering på en indirekte måte. For å løse slike begrensninger, var en Southern blot-baserte indirekte ende-merking assay, som kvantifiserer PIC-assosiert IVI-aktivitet som et mål på den endogene vDNA integrert i eksogent linearisert bakteriofag phiX174 DNA, utviklet ^{6, 7, 18.} Selv om denne metode gir et direkte mål på integrasjonshendelser, blir forholdsvis store mengder av PIC fremstilling kreves, som fortsatt er en teknisk krevendebestrebelse. For å omgå dette, ble nestet PCR-baserte analyser krever bare beskjedne mengder Pics utviklet ^{4, 5, 19.}

I denne rapporten beskriver vi en oppdatert versjon av en nestet PCR-basert in vitro metode utviklet for å rekapitulere den HIV-1 PIC-mediert integrering aktivitet oppstår under naturlig infeksjon. I denne metoden brukes cytoplasmiske ekstrakter av HIV-1-infiserte målceller som en kilde av endogen PIC-aktivitet, som er målt med en sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR). Prosedyrene for å isolere Pics og måle deres integreringsarbeidet er tilpasset, med modifikasjoner, fra protokoller utgitt av Engelman laboratorium ^20. I denne fremgangsmåten blir det PIC-assosierte integrering aktivitet initiert ved å tilveiebringe et eksogent lineært mål-DNA ^21, og DNA-produktene som skyldesdenne integrasjonen reaksjonen blir renset og anvendt som utgangsmateriale for påfølgende PCR-baserte kvantifisering. I første runde konvensjonell PCR blir viral-target DNA veikryss forsterket ved hjelp av egnede primere. I andre runde qPCR, er LTR-spesifikke primere som brukes til å spesifikt berike vDNA befolkningen fra første runde PCR produktene. Vennligst se protokollen seksjonen for en detaljert beskrivelse av denne metoden.

In vitro-studier med retrovirale Pics har ført til betydelige fremskritt i vår forståelse av mekanismen for retrovirale DNA integrasjon og i utviklingen av IN-hemmere. Basert på siste økt fokus på kartlegging HIV-1 integrering nettsteder, bestemme rollen som virus og vertsfaktorer i HIV-1 integrasjon og utvikling av nye antivirale medikamenter for å bekjempe narkotika motstand, ser vi for oss en økt interesse for og utbredt bruk av IVI analyser , som den som er beskrevet i denne rapporten. Dette i sin tur vil medførefremtidige forbedringer i metoden, og dermed spre omfanget av sine programmer.