माउस मध्यांत्रीय और colonic अनुभाग में Mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के इन विट्रो रिकॉर्डिंग में
Summary
Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Abstract
अभिवाही नसों न केवल सामान्य शरीर विज्ञान के विषय में जानकारी देने के, लेकिन यह भी परेशान homeostasis और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की ओर परिधि से अलग अंग प्रणालियों के pathophysiological प्रक्रियाओं का संकेत। जैसे, वृद्धि की गतिविधि या mesenteric अभिवाही नसों की 'संवेदीकरण' आंत अतिसंवेदनशीलता और पेट में दर्द सिंड्रोम के pathophysiology में एक महत्वपूर्ण भूमिका आवंटित किया गया है।
Mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि एक अलग आंतों खंड है कि एक उद्देश्य से बनाया अंग स्नान में मुहिम शुरू की है और जिसमें से स्प्लैनकिंक तंत्रिका अलग है, शोधकर्ताओं सीधे तंत्रिका गतिविधि जठरांत्र खंड से सटे आकलन करने के लिए अनुमति देने में इन विट्रो में मापा जा सकता है। गतिविधि मानकीकृत परिस्थितियों में बेस लाइन पर दर्ज किया जा सकता, खंड की बढ़ाव या intraluminally या serosally को जन्म दिया औषधीय यौगिकों के अलावा निम्न के दौरान। इस तकनीक की अनुमति देता हैशोधकर्ता आसानी से नियंत्रण नमूनों में परिधीय तंत्रिका तंत्र को लक्षित दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए; इसके अलावा, यह कैसे neuronal गतिविधि की बीमारी के दौरान बदल जाता है पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अभिवाही neuronal फायरिंग गतिविधि को मापने केवल जटिल न्यूरोनल में एक रिले स्टेशन झरना संकेत गठन किया है, और शोधकर्ताओं के मन में नहीं सहन अन्य स्तरों (जैसे, पृष्ठीय रूट ganglia, रीढ़ की हड्डी या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पर neuronal गतिविधि को नजरअंदाज करने के लिए करना चाहिए ) आदेश में पूरी तरह से स्वास्थ्य और रोग में जटिल न्यूरोनल शरीर क्रिया विज्ञान को स्पष्ट करने के लिए।
आमतौर पर इस्तेमाल किया अनुप्रयोगों lipopolysaccharide के प्रशासन के जवाब में neuronal गतिविधि का अध्ययन, और चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम के पशु मॉडल में अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के अध्ययन में शामिल हैं। एक अधिक translational दृष्टिकोण में, अलग-थलग माउस आंतों खंड IBS रोगियों से colonic supernatants से अवगत कराया जा सकता है। इसके अलावा, एक संशोधनइस तकनीक की हाल ही में मानव colonic नमूनों में लागू होना दिखाया गया है।
Introduction
संवेदी संकेतन और दर्द धारणा एक जटिल प्रक्रिया है कि अभिवाही नसों, रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स, आरोही और facilitatory और निरोधात्मक रास्ते उतरते और कई अलग अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया का परिणाम है। जैसे, इनमें से एक या अधिक के स्तर के पर परिवर्तन बदल संवेदी संकेतन और रोग राज्यों में आंत का दर्द हो सकता है। संवेदी सिगनल कई तकनीकों के इन सभी विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एकल कोशिका के प्रयोगों से लेकर विकसित किया गया है (जैसे, न्यूरॉन्स पर कैल्शियम इमेजिंग) पूरे पशु मॉडल (जैसे, इस तरह के visceromotor प्रतिक्रिया के रूप में व्यवहार प्रतिक्रियाओं)। तकनीक इस पत्र में वर्णित शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से छोटी आंत या कृन्तकों में पेट के एक अलग खंड से इन विट्रो में अभिवाही तंत्रिका गतिविधि का आकलन करने के लिए अनुमति देता है। संक्षेप में, एक अलग जठरांत्र खंड (आमतौर पर सूखेपन या कोलोन) एक उद्देश्य से बनाया रिकॉर्डिंग कक्ष एक शारीरिक कश्मीर के साथ perfused में रखा हैrebs समाधान। स्प्लैनकिंक तंत्रिका मुक्त विच्छेदित और एक इलेक्ट्रोड स्प्लैनकिंक या श्रोणि अभिवाही नसों में अभिवाही neuronal गतिविधि के पंजीकरण की अनुमति के लिए जुड़ा हुआ है। तंत्रिका गतिविधि basally या intraluminal दबाव और / या औषधीय यौगिकों कि या तो सीधे रिकॉर्डिंग कक्ष (serosally) में लागू किया जा सकता बढ़ रही है, या intraluminal perfusate (mucosally) के माध्यम के जवाब में अभिवाही मुक्ति 1-6 पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए दर्ज किया जा सकता । ध्यान से, स्प्लैनकिंक नसों भी अपवाही फाइबर और संवेदी afferents के अलावा viscerofugal afferents होते हैं। पूर्व vivo स्प्लैनकिंक तंत्रिका रिकॉर्डिंग के प्रमुख लाभ में से एक तथ्य यह है कि शोधकर्ताओं ने मॉडुलन या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से इनपुट के बिना तंत्रिका गतिविधि यों कर सकते हैं, तंत्रिका गतिविधि पर स्थानीय रूप से लागू यौगिकों के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक की अनुमति है। इसके अलावा, महत्वपूर्ण मापदंडों की निगरानी, के रूप में विवो दृष्टिकोण का उपयोग आवश्यक है (देखें नीचे), एन हैओ अब प्रासंगिक है। इन विट्रो स्प्लैनकिंक रिकॉर्डिंग अंत में बहुत कम समय लेने वाली अपनी इन विवो समकक्ष से।
ऐसे श्लैष्मिक पथपाकर के रूप में अन्य उत्तेजनाओं, वॉन फ्रे बाल का उपयोग कर जांच कर रही या खंड की खींच के जवाब में अभिवाही neuronal गतिविधि, एक संशोधित प्रयोगात्मक स्थापना जिसमें आंतों के ऊतकों नीचे टिकी और longitudinally खोला (जो के विपरीत है में अध्ययन किया जा सकता है एक अक्षुण्ण खंड का उपयोग) हमारे सेटअप, के रूप में पिछले एक मुद्दा 7.8 में वर्णित किया गया था। इसके अलावा, हाल ही में, एक तकनीक कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से colonic दीवार अपने आप में colonic अभिवाही तंत्रिका सक्रियण अध्ययन करने के लिए, फिर से एक नीचे टिकी, longitudinally खंड 9 खोला उपयोग वर्णित किया गया था।
इस विवो तकनीक का एक वैकल्पिक संस्करण रीढ़ की हड्डी में अभिवाही के प्रवेश के पास न्यूरोनल सक्रियण को मापने के बाहर होते हैं। संक्षेप में, बेहोश जानवर में प्रवण स्थिति, ई रखा गया हैएक तेल से भरे अच्छी तरह से चीरा की त्वचा का उपयोग और एक प्लैटिनम द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड 10,11 से अधिक पृष्ठीय नीचे का भाग draping lumbosacral रीढ़ की हड्डी laminectomy के साधन, निर्माण से ब्याज परियोजनाओं की जो अभिवाही तंत्रिका को xposing। इस तकनीक इसके अलावा शोधकर्ताओं ने बारीकी myelinated Aδ-फाइबर से उनकी चालन वेग पर आधारित फाइबर को चिह्नित करने के लिए, और भेद बिना मेलिनकृत सी फाइबर की अनुमति देता है। इसके अलावा, पृष्ठीय rootlets विशेष रूप से संवेदी अभिवाही फाइबर होते हैं, जैसा कि पहले उल्लेख मिश्रित अभिवाही और अपवाही स्प्लैनकिंक नसों के विपरीत।
पृथक पेट क्षेत्रों से इन विट्रो में अभिवाही तंत्रिका मुक्ति रिकॉर्डिंग भी मानव नमूनों का उपयोग किया जा सकता है, स्वतंत्र रूप से प्रकाशित प्रथम आदमी मानव लकीर में colonic अभिवाही तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्डिंग पांडुलिपियों नमूनों 12,13 दो अनुसंधान समूहों के रूप में। इस तकनीक के कार्यान्वयन के लिए एक और अधिक आसानी से translati में हो सकता हैमानवीय राज्य के लिए murine डेटा के पर, और शोधकर्ताओं आसानी से अवगत संवेदी तंत्रिका को लक्षित दवाओं की पहचान के लिए अनुमति दे सकता है। अभिवाही तंत्रिका गतिविधि, साथ ही नए चिकित्सीय अभिकर्मकों कि अत्यधिक अभिवाही तंत्रिका गतिविधि लक्ष्य की खोज निस्र्पक के नैदानिक महत्व, अलंकृत क्षेत्र 14-19 में कई विशेषज्ञों ने चर्चा की गई है।
ऊपर उल्लिखित इन विट्रो तकनीक का पूरक है और आमतौर पर अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के vivo माप में जाना जाता है। इन विवो neuronal गतिविधि माप के दौरान, तंत्रिका गतिविधि बेहोश पशु के दौरान जो ब्याज की खंड की पहचान की है और बाद में intubated में सीधे मापा जा सकता है, और एक तरल आयल भरा अच्छी तरह से पेट की दीवार और कृंतक 20 की त्वचा का उपयोग निर्माण किया है। ब्याज की अभिवाही तंत्रिका तो, पहचान sectioned और एक द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड प्लैटिनम पर रखा, neuronal गतिविधि की अनुमति है measuremenटी। इस तकनीक को बेहोश जानवरों यद्यपि जीने में अभिवाही तंत्रिका गतिविधि मिलाना शोधकर्ता अनुमति देता है; जैसे, एक ऐसी ल्यूमिनल बढ़ाव या एक यौगिक की नसों में प्रशासन के रूप में हस्तक्षेप का जवाब neuronal गतिविधि का अध्ययन कर सकते हैं।
ट्रांसलेशनल अनुसंधान आजकल मुख्य रूप से मानव व्युत्पन्न supernatants के आवेदन पर केंद्रित है (जैसे।, Colonic बायोप्सी, खेती परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear, आदि से) मध्यांत्रीय और / या colonic माउस afferents 21,22 पर। शोधकर्ताओं ने सीधे, या तो अंग स्नान में या intraluminal समाधान है कि आंत्र खंड perfuses में supernatants आवेदन कर सकते हैं इसलिए serosal श्लैष्मिक आवेदन बनाम की है कि अंतर प्रभाव अभिवाही तंत्रिका मुक्ति पर अध्ययन किया जा सकता है। जैसे, यह दिखाया गया था चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम के साथ रोगियों से कि colonic श्लैष्मिक बायोप्सी supernatans माउस colonic afferents, गिनी पिग submucous न्यूरॉन्स और माउस पृष्ठीय रूट में अतिसंवेदनशीलता पैदा कर सकता हैनाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स 21,23,24।
अंत में, neuronal गतिविधि रिकॉर्डिंग mesenteric तक ही सीमित नहीं है और / या श्रोणि न्यूरॉन्स जठरांत्र पथ innervating। दूसरों को दिखा दिया है कि तंत्रिका रिकॉर्डिंग संयुक्त घुटने से 25 की आपूर्ति afferents में प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि दूसरों को मूत्राशय अभिवाही तंत्रिका गतिविधि की विशेषता है के रूप में अच्छी तरह से 26-28, और दिखा दिया कि मूत्राशय से श्रोणि afferents के रूप में अच्छी तरह से जठरांत्र संबंधी मार्ग एकाग्र, संभवतः न्यूरोनल में जिसके परिणामस्वरूप crosstalk 29।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में प्रोटोकॉल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगशाला तकनीक का वर्णन के रूप में हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा इस्तेमाल किया 3,4,7,8,12,20,21,31 कृन्तकों में mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि का अध…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
Materials
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
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