In Vitro Registratie van Mesenteriale afferente zenuw activiteit in het Muis jejunale en Colonic Segmenten
Summary
Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Abstract
Afferente neuronen niet alleen informatie over te brengen over de normale fysiologie, maar ook het signaal verstoorde homeostase en pathofysiologische processen van de verschillende orgaansystemen van de periferie naar het centrale zenuwstelsel. Als zodanig is de toegenomen activiteit of "sensibilisatie" van mesenteriale afferente zenuwen toegewezen een belangrijke rol in de pathofysiologie van viscerale overgevoeligheid en buikpijn syndromen.
Mesenterische afferente zenuwactiviteit kan worden gemeten in vitro een geïsoleerde intestinale segment dat in een speciaal gebouwde orgaanbad gemonteerd en waarvan de splanchnische zenuw wordt geïsoleerd, waardoor onderzoekers zenuwactiviteit naast het maag-segment direct beoordelen. Activiteit kan worden opgenomen in de uitgangssituatie in gestandaardiseerde omstandigheden, tijdens uitzetting van het segment of na de toevoeging van farmacologische verbindingen intraluminaal of serosally opgeleverd. Deze techniek maaktde onderzoeker om het effect van geneesmiddelen gericht het perifere zenuwstelsel controlemonsters gemakkelijk bestuderen; bovendien biedt belangrijke informatie over neuronale activiteit wordt veranderd bij ziekte. Er moet echter worden opgemerkt dat het meten van afferente neuronale activiteit alleen vormt een relaisstation in de complexe neuronale signalering cascade, en onderzoekers moeten in gedachten houden niet neuronale activiteit kijken uit op andere niveaus (bijvoorbeeld, de ganglia, ruggenmerg of het centrale zenuwstelsel ) om de complexe neuronale fysiologie bij gezondheid en ziekte volledig te helderen.
Gebruikte toepassingen omvatten het onderzoek van neuronale activiteit in reactie op de toediening van lipopolysaccharide en de studie van afferente zenuwactiviteit in diermodellen van het prikkelbare darmsyndroom. In een translationele benadering kan het geïsoleerde muis intestinale segment worden blootgesteld aan colon supernatanten van IBS-patiënten. Bovendien is een wijzigingvan deze techniek is onlangs aangetoond in menselijke colon specimens toepassing.
Introduction
Zintuiglijke signalering en pijnperceptie is een complex proces dat voortvloeit uit een ingewikkeld samenspel van afferente zenuwen, ruggenmerg neuronen, stijgende en dalende faciliterende en remmende paden en verschillende hersengebieden. Als zodanig kunnen veranderingen in één of meer van deze niveaus resulteren in gewijzigde zintuiglijke signalering en ingewandspijn bij ziektetoestanden. Om al deze verschillende aspecten van zintuiglijke signalering meerdere technieken te bestuderen zijn ontwikkeld variërend van eencellige experimenten (bijvoorbeeld calcium beeldvorming op neuronen) op hele diermodellen (bijvoorbeeld gedragsreacties zoals visceromotor respons). De in dit document beschreven techniek stelt onderzoekers in staat om specifiek te beoordelen afferente zenuwactiviteit in vitro van een geïsoleerd segment van de dunne darm of dikke darm bij knaagdieren. Kortom, een geïsoleerd maag-segment (meestal jejunum of colon) gemonteerd in een speciaal gebouwde opname kamer geperfuseerd met een fysiologische KRebs oplossing. De Nervi Splanchnici is gratis ontleed en verbonden met een elektrode waardoor registratie van afferente neuronale activiteit in splanchnisch of bekken afferente zenuwen. Zenuwactiviteit kan basaal of in antwoord op toenemende intraluminale druk en / of farmacologische samenstelling die direct in de opname kamer (serosally) kan worden aangebracht, of via de intraluminale perfusaat (mucosaal) om hun effect op afferente ontlading 1-6 evalueren geregistreerd . We merken splanchnische zenuwen bevatten ook efferente vezels en viscerofugal afferenten naast de sensorische afferenten. Een van de grote voordelen van ex vivo splanchnicus zenuw opname is dat onderzoekers zenuwactiviteit kan kwantificeren zonder modulatie of een signaal van het centrale zenuwstelsel, zodat men de rechtstreekse werking van lokaal toegediende verbindingen op zenuwactiviteit bestuderen. Bovendien controleren van vitale parameters, zoals noodzakelijk is met de in vivo benadering (zie hieronder), no langer relevant. In vitro splanchnisch opname is uiteindelijk veel minder tijd in beslag dan de in vivo tegenhanger.
Afferente neuronale activiteit in respons op andere stimuli, zoals mucosale strelen, indringende behulp von Frey haren of strekken van het segment, kan worden onderzocht in een gemodificeerde experimentele opstelling waarin het darmweefsel wordt vastgepind en longitudinaal geopend (dit in tegenstelling tot onze opstelling met behulp van een intact segment), zoals werd beschreven in een vorige uitgave 7,8. Bovendien, pas onlangs, een techniek werd beschreven aan de dikke afferente zenuwen activering studeren in de dikke wand zelf via calcium imaging, opnieuw met een vastgepind, longitudinaal geopend segment 9.
Een alternatieve versie van deze in vivo techniek bestaat uit het meten neuronale buurt vermelding afferente's in het ruggenmerg. Kortom, het verdoofd dier geplaatst in buikligging, exposing het lumbosacrale ruggenmerg waaraan de afferente zenuw van belang projecten door middel van laminectomie, de bouw van een paraffine gevuld en met behulp van de huid van de incisie en draperen de dorsale worteltje over een platina-bipolaire elektrode 10,11. Deze techniek maakt voorts onderzoekers vezels op basis van hun geleidingssnelheid karakteriseren en te onderscheiden gemyeliniseerde C-vezels uit dun gemyeliniseerde Aδ-vezels. Bovendien dorsale wortels bevatten uitsluitend sensorische afferente vezels, in tegenstelling tot de gemengde afferente en efferente zenuwen ingewands eerder vermeld.
Opname afferente zenuwactiviteit in vitro van geïsoleerde darm segmenten kan ook worden gedaan met behulp van menselijke specimens, als twee onderzoeksgroepen onafhankelijk gepubliceerd first-in-man manuscripten opnemen colon afferente zenuw activiteit in het menselijk resectie exemplaren 12,13. De toepassing van deze techniek kan leiden tot een beter vertalinop van muizen gegevens aan de menselijke staat, en kan leiden tot onderzoekers gemakkelijk drugs richten op de gesensibiliseerd gevoelszenuw identificeren. De klinische betekenis karakteriseren de afferente zenuwactiviteit, en de ontdekking van nieuwe therapeutische reagentia die gericht buitensporige afferente zenuwactiviteit is uitvoerig besproken door vele deskundigen op het gebied 14-19.
De voornoemde in vitro techniek vormt een aanvulling op de meer algemeen in vivo meten van afferente zenuwactiviteit bekend. Tijdens de in vivo neuronale activiteit meting kan zenuwactiviteit direct worden gemeten in de verdoofde dier waarin het segment van belang geïdentificeerd en vervolgens geïntubeerd en een vloeibare paraffine gevulde goed geconstrueerd met de buikwand en de huid van het knaagdier 20. De afferente zenuw van belang wordt vervolgens geïdentificeerd, doorgesneden en op een bipolaire platina-elektrode, waardoor neuronale activiteit measurement. Deze techniek maakt het mogelijk de onderzoeker afferente zenuwactiviteit moduleren in levende zij gesedeerd dieren; als zodanig kan men neuronale activiteit reageert op storingen zoals luminale uitzetting of intraveneuze toediening van een verbinding bestuderen.
Translationeel onderzoek richt zich tegenwoordig vooral op de toepassing van humaan afgeleide supernatanten (bijv., Uit colon biopten, gekweekte perifere mononucleaire cellen, enzovoort) op jejunale en / of colon muis afferenten 21,22. Onderzoekers kunnen direct supernatants zijn hetzij in het orgel bad of in de intraluminale oplossing die de darm segment perfundeert, zodat de differentiële effecten van serosal versus mucosale applicatie kan worden bestudeerd op afferente zenuwactiviteit. Zo werd aangetoond dat colonic mucosale biopsie supernatans van patiënten met prikkelbare darmsyndroom kan overgevoeligheid bij muizen colon afferenten, cavia submukeuze neuronen en muis dorsale wortel veroorzakenganglion neuronen 21,23,24.
Tenslotte opname neuronale activiteit is niet beperkt tot de mesenteriale en / of bekken neuronen innerveren het maagdarmkanaal. Anderen hebben aangetoond dat zenuw opnames in afferentia kan worden uitgevoerd leveren van het kniegewricht 25, terwijl anderen blaas afferente zenuwactiviteit hebben gekenmerkt en 26-28, en toonde aan dat het bekken afferentia uit de blaas en het maagdarmkanaal convergeren, mogelijk resulterend in neuronale 29 overspraak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol in dit document beschrijft een reproduceerbare laboratoriumtechniek om mesenteriale afferente zenuw activiteit in knaagdieren zoals gebruikt door onze groep en anderen 3,4,7,8,12,20,21,31. Kritische stappen in het protocol onder meer de snelle isolatie van het weefsel, het streven van de zenuw streng in de zuig-elektrode en de adequate 'verzegelen' van het glazen capillair van het orgel bad door opzuigen omliggende vetweefsel in het capillair. De opening van de glazen capillaire nauwkeuri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
Materials
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
Referências
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man’: characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
