في المختبر تسجيل من مساريقي وارد آخر الأعصاب في ماوس صائمية وقطاعات القولون
Summary
Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Abstract
الأعصاب وارد ليس فقط نقل المعلومات المتعلقة علم وظائف الأعضاء طبيعي، ولكن أيضا إشارة توازن مختل والعمليات الفيزيولوجية المرضية لأجهزة الجسم المختلفة من المحيط نحو الجهاز العصبي المركزي. على هذا النحو، وقد تم تخصيص زيادة النشاط أو "توعية" من الأعصاب وارد المساريقي دورا هاما في الفيزيولوجيا المرضية من فرط الحساسية الحشوية ومتلازمات الألم في البطن.
يمكن قياس النشاط عصب وارد المساريقي في المختبر في شريحة المعوية المعزولة التي شنت في حمام الجهاز بنيت لهذا الغرض والتي يتم عزل العصب الحشوي، مما يسمح للباحثين لتقييم مباشرة نشاط العصب المجاور إلى الجزء الهضمي. آخر يمكن تسجيلها في الأساس في ظروف موحدة، أثناء انتفاخ الجزء أو بعد إضافة المركبات الدوائية تسليمها intraluminally أو serosally. تسمح هذه التقنيةالباحث إلى دراسة بسهولة تأثير المخدرات التي تستهدف النظام العصبي الطرفي في عينات السيطرة؛ الى جانب ذلك، فإنه يوفر معلومات مهمة حول كيفية نشاط الخلايا العصبية يتم تبديل أثناء المرض. وتجدر الإشارة إلى أنه مع ذلك أن قياس النشاط اطلاق العصبية وارد يشكل سوى محطة ترحيل واحدة في الخلايا العصبية المعقدة يشير التعاقبي، ويجب على الباحثين أن يضعوا في الاعتبار عدم إغفال نشاط الخلايا العصبية في المستويات الأخرى (على سبيل المثال، العقد الجذرية الظهرية، والحبل الشوكي أو الجهاز العصبي المركزي ) من أجل التوضيح التام لعلم وظائف الأعضاء العصبية المعقدة في الصحة والمرض.
وتشمل التطبيقات المستخدمة عادة لدراسة نشاط الخلايا العصبية في استجابة لإدارة lipopolysaccharide في، ودراسة النشاط عصب وارد في نماذج حيوانية من متلازمة القولون العصبي. في اتباع نهج أكثر متعدية، والجزء المعوية الماوس معزولة يمكن أن يتعرض لsupernatants القولون من مرضى القولون العصبي. وعلاوة على ذلك، تعديلهذه التقنية وقد تبين مؤخرا أن تكون قابلة للتطبيق في عينات القولون الإنسان.
Introduction
الإشارات الحسية والإحساس بالألم هي عملية معقدة الذي ينتج عن تفاعل معقد بين الأعصاب وارد، الخلايا العصبية في العمود الفقري، وتصاعدي تنازلي مسارات تيسيري والمثبطة وعدة مناطق الدماغ المختلفة. على هذا النحو، والتغيرات في واحدة أو أكثر من هذه المستويات قد يؤدي إلى الإشارات الحسية المتغيرة والألم الحشوية في الحالات المرضية. لدراسة كل هذه الجوانب المختلفة من الإشارات الحسية تقنيات متعددة تم تطويرها بدءا من التجارب خلية واحدة (على سبيل المثال، والتصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية) على النماذج الحيوانية كلها (على سبيل المثال، والاستجابات السلوكية مثل استجابة الحشوي الحركي). تقنية الموضحة في هذه الورقة تسمح للباحثين لتقييم تحديدا النشاط عصب وارد في المختبر من الجزء المعزول من الأمعاء الدقيقة أو القولون في القوارض. باختصار، هي التي شنت على قطاع الهضمي معزولة (عادة الصائم أو القولون) في غرفة تسجيل بنيت لهذا الغرض مع perfused لK الفسيولوجيةحل rebs. يتم تشريح العصب الحشوي الحر وتوصيلها إلى القطب يسمح بتسجيل نشاط الخلايا العصبية وارد في الأعصاب وارد حشوي أو الحوض. النشاط العصبي ويمكن أن تسجل باسالي أو استجابة لتزايد الضغوط داخل اللمعة و / أو المركبات الدوائية التي يمكن تطبيقها إما مباشرة إلى غرفة تسجيل (serosally)، أو عن طريق الإرواء داخل اللمعة (mucosally) لتقييم تأثيرها على أداء وارد 1-6 . من المذكرة، تحتوي على الأعصاب الحشوية أيضا ألياف صادرة وafferents viscerofugal بالإضافة إلى afferents الحسية. واحدة من المزايا الرئيسية لتسجيل العصب الحشوي خارج الجسم الحي هو حقيقة أن الباحثين يمكن تحديد حجم نشاط العصب دون تعديل أو إدخال من الجهاز العصبي المركزي، مما يسمح احد لدراسة التأثير المباشر لمركبات تطبيقها محليا على النشاط العصبي. وعلاوة على ذلك، رصد العوامل الحيوية، كما هو ضروري باستخدام هذا النهج في الجسم الحي (انظر أدناه)، غير نس تعد ذات صلة. في المختبر تسجيل حشوي هو في النهاية أقل بكثير من نظيرتها في الجسم الحي تستغرق وقتا طويلا.
نشاط الخلايا العصبية وارد في استجابة للمؤثرات أخرى، مثل التمسيد المخاطية، التحقيق باستخدام الشعر فون فراي أو تمتد من الجزء، ويمكن دراستها في الإعداد التجريبية المعدلة التي يتم يعلق الأنسجة المعوية أسفل وفتح طوليا (والذي هو على النقيض من الإعداد لدينا باستخدام شريحة سليمة)، كما وصفت في قضية سابقة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، إلا في الآونة الأخيرة، وقد وصفت تقنية لدراسة تفعيل وارد عصب القولون في جدار القولون نفسه عن طريق التصوير الكالسيوم، مرة أخرى باستخدام تمركزها، فتحت طوليا شريحة 9.
نسخة بديلة من هذه التقنية في الجسم الحي يتكون من قياس تنشيط الخلايا العصبية قرب دخول وارد في في الحبل الشوكي. باختصار، يتم وضع الحيوان تحت التخدير في وضعية الانبطاح، هxposing الحبل الشوكي القطنية العجزية التي العصب وارد من المشاريع الفائدة عن طريق الثقب، بناء جيدا باستخدام الجلد من شق واللف جذير ظهري فوق القطب البلاتين القطبين 10،11 مليئة البارافين. هذه التقنية علاوة على ذلك يسمح للباحثين لتوصيف الألياف على أساس سرعة التوصيل، ووتميز كمون الفعل C-الألياف من العصبي رقيقة Aδ ألياف. وعلاوة على ذلك، rootlets الظهري يحتوي حصرا الألياف وارد الحسية، وعلى النقيض من وارد وصادر الأعصاب الحشوية المختلطة التي سبق ذكرها.
تسجيل التفريغ عصب وارد في المختبر من قطاعات الأمعاء المعزولة يمكن أيضا أن يتم ذلك باستخدام العينات البشرية، واثنين من المجموعات البحثية التي نشرت بشكل مستقل المخطوطات الأولى في رجل وتسجيل النشاط عصب وارد القولون في استئصال البشري العينات 12،13. تنفيذ هذه التقنية يمكن أن يؤدي إلى أكثر بسهولة translatiعلى البيانات الفئران للدولة إنسانية، ويمكن أن تسمح للباحثين لتحديد الأدوية التي تستهدف العصب الحسي توعية بسهولة. أهمية سريرية من تميز نشاط ارد العصبية، فضلا عن اكتشاف الكواشف العلاجية الجديدة التي تستهدف النشاط عصب وارد باهظة، وقد نوقشت بشكل متقن من قبل العديد من الخبراء في هذا المجال 14-19.
في المختبر التقنية المذكورة آنفا تكمل المعروفة أكثر في قياس الجسم الحي من النشاط وارد العصبية. خلال المجراة قياس نشاط الخلايا العصبية، والنشاط العصبي ويمكن أن تقاس مباشرة في الحيوان مخدرا خلالها يتم التعرف على جزء من الفائدة وتنبيب في وقت لاحق، وبناء على البارافين مليئة السائل جيدا باستخدام جدار البطن والجلد من القوارض 20. ثم يتم التعرف على الأعصاب وارد من الفائدة، مقطوع ووضعها على قطب البلاتين القطبين، مما يسمح measuremen نشاط الخلايا العصبيةت. هذا الأسلوب يسمح للباحث لتعديل النشاط عصب وارد في العيش ولو الحيوانات مخدرا. على هذا النحو، يمكن للمرء أن دراسة نشاط الخلايا العصبية الاستجابة لتدخلات مثل انتفاخ اللمعية أو في الوريد إدارة مجمع.
يركز الأبحاث المترجمة في الوقت الحاضر أساسا على تطبيق supernatants المستمدة الإنسان (على سبيل المثال، من الخزعات القولون، المزروعة الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى، الخ) على afferents الماوس صائمية و / أو القولون 21،22. يمكن للباحثين تنطبق مباشرة supernatants إما في حمام الجهاز أو في حل داخل اللمعة التي perfuses قطاع الأمعاء، بحيث الآثار التفاضلية للالمصلي مقابل تطبيق المخاطية يمكن دراستها على تفريغ عصب وارد. على هذا النحو، فقد تبين أن supernatans خزعة مخاطية القولون من المرضى الذين يعانون من متلازمة القولون العصبي يمكن أن تسبب فرط الحساسية في afferents القولون الماوس، خنزير غينيا الخلايا العصبية تحت المخاطية وجذور الماوس الظهريةالخلايا العصبية العقدية 21،23،24.
وأخيرا، وتسجيل نشاط الخلايا العصبية لا يقتصر على المساريقي و / أو الخلايا العصبية الحوض التعصيب الجهاز الهضمي. وقد أظهرت آخرون أن التسجيلات العصبية يمكن أن يؤديها في afferents تزويد مفصل الركبة 25، في حين أن البعض الآخر تتميز المثانة النشاط وارد العصبية فضلا 26-28، وتدلل على أن afferents الحوض من المثانة وكذلك الجهاز الهضمي تتلاقى، وربما أدى إلى العصبية الحديث المتبادل 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول في هذه الورقة يصف تقنية المختبرات استنساخه لدراسة النشاط العصبي وارد المساريقي في القوارض كما يستخدمه مجموعتنا وغيرها 3،4،7،8،12،20،21،31. وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول العزلة السريع للأنسجة، تطلع حبلا العصب في القطب الشفط و "الختم" كاف من الزج?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
Materials
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
Referências
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man’: characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
