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Neurociência

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

Published: September 08, 2016
doi:
10.3791/54567
,
1Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo, 2Laboratory for Cell Polarity Regulation, Quantitative Biology Center,RIKEN

Summary

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Abstract

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

Introduction

The rapid transmission of sensory and motor information in the peripheral nervous system is permitted by the myelin sheath, which is formed by myelinating Schwann cells (SCs)1. Insulation of axons by the myelin sheath enables saltatory conduction, which increases the speed of nerve impulses. In disorders in which the development or maintenance of the myelin sheath is impaired, nerve conduction speed is reduced. This results in neuropathy involving motor and sensory dysfunction. Although there are many studies on the molecular mechanisms of myelination and demyelination in the peripheral nervous system, the roles of the numerous proteins involved in these processes remain unclear.

To study the molecular mechanisms of SC myelination/demyelination in vivo, genetic approaches have been used to modify gene expression in animals. A powerful approach is the use of knockout/knockin or transgenic animals. However, the generation of these animals is expensive and time consuming. For SC-specific gene manipulation, crossing floxed strains with Cre mice or other conditional gene expression methods are necessary. This again is laborious and time intensive. In recent years, a cutting-edge genetic technology, the CRISPR-Cas9 system, has made the generation of genetically modified mice much quicker (about 4 weeks)2,3, but this method is hindered by target sequence limitations, and suffers from off-target effects. As an alternative method, viral vector-mediated gene transfer is a faster and easier method of achieving gene transfer into SCs in vivo4-6. Indeed, the generation of viral vectors is less expensive, and takes a shorter time (within a few weeks), and gene manipulation of SCs can be achieved by simply injecting engineered viral vectors, such as adenoviral vectors, adeno-associated viral (AAV) vectors, and lentiviral vectors, into the sciatic nerve. Because these viral vectors have different characteristics, users have to choose the one best suited for their purpose. Adenoviral vectors infect axons and SCs in both young and mature sciatic nerves. In particular, adenoviral vectors have higher selectively for non-myelinating SCs than myelinating SCs. Adenoviruses can cause immune responses, and accordingly, immunodeficient strains should be used5. AAV vectors are currently the most widely used viral vectors, and allow in vivo gene transfer with lower toxicity7. AAV can transduce both axons and SCs by direct injection into the nerve fibers8,9. However, AAV-mediated protein expression usually requires 3 weeks or longer to reach maximum levels7,9. Therefore, it is difficult to analyze myelination, which actively progresses during the two week postnatal period. Lentiviral vectors have higher selectively for myelinating SCs than non-myelinating SCs, and do not have toxic effects on sciatic nerves. However, lentiviral vectors do not infect SCs in more mature nerves5, and therefore are unsuitable for analyzing events such as the demyelination process.

Electroporation is another faster and easier approach to achieve in vivo gene transfer. It has been reported that in vivo transfection of SCs can be achieved when electroporation is applied to transected rat sciatic nerves10. However, because this method requires nerve transection for gene delivery, the application is limited to the analysis of the damaged nerves. Here, we describe an alternative method that allows the delivery of transgenes into myelinating SCs in intact rat sciatic nerves using electroporation11. This method requires plasmid construction, which can usually be completed within a week. Then, by simply delivering electric pulses to the site on the sciatic nerve where the plasmid DNA was injected, highly selective transfection of myelinating SCs can be achieved in neonatal as well as in more mature animals. By electroporating multiple plasmids, simultaneous expression of a variety of genes can be easily achieved. The ability to simultaneous express multiple molecules, such as signaling proteins, short-hairpin RNAs (shRNAs) and functional probes, is crucial for investigating complex processes such as myelination and demyelination. The novel in vivo electroporation method described in this paper will be a powerful tool, allowing researchers to analyze the function of a multitude of molecules and their interactions in myelinating SCs.

Protocol

L'uso di topi per la ricerca era in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato di benessere degli animali l'Università di Tokyo. 1.Preparazione di plasmidi DNA Generare plasmidi DNA per elettroporazione in vivo subcloning cDNA o la sequenza shRNA in un plasmide di espressione per cellule di mammifero 12. Utilizzare un citomegalovirus immediato primi enhancer e pollo β-actina promotore di fusione (CAG) promotore-driven plasmide 13 perché permette l'espressione forte e stabile. Per espressione shRNAs sotto il controllo di un promotore CAG, utilizzare un sistema a cassette shRNA mir30-based per la subcloning shRNA 14. Purificare il DNA plasmide con un kit di maxi-prep secondo le istruzioni del fabbricante, e risospendere il DNA con soluzione salina HEPES-buffered (140 mM NaCl, 0,75 mm Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7,40). Regolare la concentrazione del DNA per ≥4 mg / mL. <li> Preparare la soluzione plasmide DNA ad una concentrazione di 4 mg / mL, e aggiungere una quantità minima di colorante verde veloce (concentrazione finale di 0,01%) per etichettare il sito di iniezione. Quando è richiesto elettroporazione simultanea di più plasmidi, regolare la concentrazione totale della soluzione plasmide DNA a 4 mg / mL. Nota: La composizione ottimale dei DNA plasmidici deve essere determinata secondo la efficienza di trasfezione di ciascun plasmide. 2. sterilizzazione degli strumenti chirurgici e Saline strumenti chirurgici autoclave e la soluzione di NaCl allo 0,9%. 3. Preparazione della micropipetta di vetro Tirare pipette di vetro con un estrattore pipetta. Tagliare la punta della pipetta ad un diametro di 30-50 micron. Utilizzare i seguenti parametri: Calore, 600; Velocity, 50; Ora, 75. 4. Chirurgia Animale, iniezione del DNA ed elettroporazione Nota: Un overvista di questa fase è descritta in Figura 1. Sebbene la procedura di cuccioli di ratto sono descritti qui, il metodo è applicabile anche ad animali più maturi utilizzando la stessa procedura. Anestetizzare ratto con isoflurano nella casella di induzione finché l'animale diventa immobile regolando il flusso di ossigeno al 0,4 L / min e la concentrazione isoflurano al 4% (vol / vol). Eseguire punta pizzicare per confermare il corretto anestesia. Mettere il topo sul caldo caldo sotto un microscopio binoculare, e mantenere l'anestesia con la somministrazione continua isoflurano attraverso la maschera. Regolare il flusso di ossigeno al 0,2 L / min e la concentrazione isoflurano al 2% (vol / vol). Utilizzare collirio per prevenire la secchezza degli occhi se gli occhi dell'animale sono aperte. Fissare le gambe con nastro chirurgico. Pulire la pelle sulla coscia posteriore con iodopovidone, e fare un'incisione con un bisturi. Nota: Rasatura aree chirurgiche se le aree chirurgiche sono coperte con haria. Esporre il nervo sciatico, creando un varco tra le muscolo quadricipite femorale e del muscolo bicipite femorale con aghi da cucito. Bagnare il nervo con 0,9% soluzione di NaCl. Assorbire l'acqua in eccesso con carta privo di lanugine. Inserire la base di una micropipetta di vetro sulla tubazione flessibile, e riempire la quantità adeguata di soluzione di DNA (almeno un microlitro) nella micropipetta aspirando delicatamente. Sollevare il nervo scoperto tirando delicatamente la parte distale del nervo utilizzando un ago. Nota: Non applicare tensione al nervo per minimizzare lo stress meccanico. Inserire la micropipetta di vetro nel sito distale sul nervo, ed iniettare la soluzione di DNA dalla pressione applicando (cioè soffiando nell'estremità aperta del tubo flessibile). Iniettare soluzione di DNA fino a quando il nervo appare verde (massimo 1 ml). A causa frequente inserimento del micropipetta può danneggiare il nervo, non inserire la micropipetta più di due volte. Posizionare un tweEzer-tipo di platino elettrodo circa 1-2 mm di distanza dal nervo. Colmare il divario tra l'elettrodo e il nervo con 0,9% soluzione di NaCl. Nota: Non tenere il nervo con l'elettrodo per evitare sollecitazioni meccaniche sul nervo. Applicare impulsi elettrici al sito di iniezione utilizzando un elettroporatore con l'elettrodo. Dopo il primo set impulso, invertire l'elettrodo e applicare un altro set di impulso. Utilizzare i seguenti parametri: tensione, 50 V; durata dell'impulso, 5 msec; Intervallo di impulso, 100 msec; numero di impulsi, 4 volte. Pulire il sito di elettroporazione con il 0,9% soluzione di NaCl. Ripetere i passaggi 4,4-4,11 sul nervo sciatico controlaterale. 5. Post-elettroporazione Chiudere le incisioni con la colla cianoacrilato. Dopo l'essiccazione della colla, pulire la ferita con povidone-iodio. Rilasciare il cucciolo dalla maschera facciale. Riscaldare il cucciolo su un riscaldatore per almeno un'ora in modo da consentire di recuperare completamente dall'anestesia. Do non lasciare il cucciolo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente. Dopo il recupero dall'anestesia, restituire il cucciolo di ratto madre. Non restituire il cucciolo fino alla completa guarigione. 6. post-intervento chirurgico Casa i cuccioli di ratto in gabbia fino a condurre gli esperimenti 11 (si vedano gli esempi in figura 3). Somministrare carprofen (5 mg / kg, ip), un farmaco non steroideo anti-infiammatori, o buprenorfina (0,1 mg / kg, sc), un analgesico oppioide, se necessario. Nota: se il cucciolo di ratto non cresce bene o infiammazione si osserva attorno al sito chirurgico, escludere l'animale dagli esperimenti.

Representative Results

Un esempio di un nervo sciatico transfettate con la proteina fluorescente rossa (RFP) esprimente il plasmide è mostrato in Figura 2A. Le cellule che mostrano la morfologia bipolare, una caratteristica della SCS, sono stati scarsamente trasfettate con RFP. No RFP fluorescenza è stato rilevato negli assoni. Noi di solito troviamo ~ 100 SC trasfettate in ogni nervo. Questa efficienza trasfezione sembra simile alla SC efficienza in vivo infezione utilizzando vettori lentivirali 4. Esperimenti immunostaining hanno dimostrato che la maggior parte (~ 96%) cellule RFP-positive a P7 co-marcato per S100, un marcatore SC (Figura 2B) e 91% di cellule RFP-positive a P14 co-marcato per MBP, un marcatore myelinating SC (Figura 2C), suggerendo che il trasferimento genico mediante elettroporazione è altamente selettivo per mielinizzanti SC. L'introduzione di geni multipli in SC <em> in vivo sarà estremamente utile per studiare i meccanismi di mielinizzazione / demielinizzazione. Uno dei principali vantaggi del metodo nel vivo elettroporazione qui descritto è la capacità di trasferire geni multipli con una procedura semplice. La figura 2D mostra un'immagine rappresentativa di un nervo sciatico trasfettate con una miscela di GFP e RFP plasmidi che esprimono l'utilizzo nel elettroporazione in vivo. Circa il 97% di SC erano GFP e RFP doppio positive, suggerendo che la consegna altamente efficiente di geni multipli può essere ottenuto semplicemente electroporating miscele di diversi plasmidi. Nei roditori, mielinizzazione inizia intorno nascita, aumentando notevolmente durante le prime due settimane dopo la nascita, e quindi diminuisce gradualmente. Così, manipolando geneticamente SC durante queste finestre temporali di sviluppo, i meccanismi alla base di queste diverse fasi di mielinizzazione possono essere chiarite. vettori lentivirali sono un ottimo strumento per unnalyzing mielinizzazione, in particolare per quanto hanno tossicità minima, ma lentivirus di infettare solo neonatale nervi sciatico 5,6. In confronto, il trasferimento genico elettroporazione mediata funziona bene quando trasfezione viene condotta su P3 (figura 2E, in alto) o P14 (Figura 2E, bottom). Le applicazioni del romanzo nel metodo di elettroporazione in vivo sono descritte qui. La figura 3A mostra le immagini microscopiche luce di GFP che esprimono SC mielinizzanti a vari stadi di sviluppo (P7, P14, P21 e P31). Con analisi al microscopio ottico, alterazioni dei parametri morfologici, come la lunghezza e il diametro, possono essere valutate. Si noti che questi parametri hanno valori simili rispetto al intatto ratto nervi periferici 15,16, il che suggerisce che i nervi elettroporate si sviluppano senza rilevanti conseguenze dannose. La figura 3B mostra un elettrone un'immagine microscopica della LacZ-espresssing mielinizzanti SC. In questo caso, LacZ è stato utilizzato come indicatore di espressione. β-galattosidasi colorazione utilizzando bluO-gal, un substrato di etanolo insolubile, consente l'analisi della struttura della mielina del SC trasfettate al microscopio elettronico 11,17. In questi esperimenti, il ruolo delle molecole di segnalazione può essere esaminato da tacere o aumentando la loro espressione, consentendo in tal modo l'analisi di perdita-di-funzione o il guadagno-di-funzione effetti. Oltre all'analisi di tessuto fissato, in vivo trasferimento genico elettroporazione mediata può essere applicato anche a vivere esperimenti di imaging. Ad esempio, la Figura 3C mostra una myelinating SC co-esprimono G-GECO1.1 18, un indicatore verde fluorescente citosolico Ca 2+, e R-GECO1mt 19, un indicatore rosso fluorescente mitocondriale Ca 2+. Esprimendo questi indicatori, abbiamo identificato un percorso di segnalazione che controlla citosoliche e mitocondriali Ca 2+ concentrazioni in mielinizzanti SC . Pertanto, il presente metodo può essere usato per studiare una varietà di meccanismi di segnalazione, in particolare quando le sonde fluorescenti geneticamente codificati sono disponibili per rilevare i segnali di interesse. Figura 1:. Schematica della i n elettroporazione in vivo Metodo Innanzitutto, il nervo sciatico del ratto anestetizzato è esposto. In secondo luogo, il plasmide DNA viene iniettato nel nervo sciatico. In terzo luogo, gli impulsi elettrici vengono consegnati al sito di iniezione attraverso l'elettrodo a forma di pinza. Infine, la ferita viene chiusa con colla. Questa procedura può essere ripetuta sul nervo controlaterale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. "> Figura 2: Risultati Rappresentante sui nervi sciatico trasfettate (A) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico transfettate.. Il nervo è stato transfettate con plasmide RFP che esprimono al P3, e fissato a P7. (B) Una immagine rappresentativa di una cellula RFP-transfettate a P7 mostrando colocalizzazione con S100, un marker SC. (C) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico RFP-trasfettate a P14 che mostra colocalizzazione con MBP, un marker myelinating SC. (D) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico cotransfected con GFP e RFP plasmidi che esprimono. SC trasfettate espresso contemporaneamente GFP e RFP. (E) Un'immagine di mielinizzanti SC a P31 trasfettate al P3, quando inizia la mielinizzazione (in alto), e un'immagine della SCS mielinizzanti a P31 transfettate a P14, quando la maggior parte di grandi assoni diventano mielinato (in basso), suggerendo che trasfezione di SC mielinizzanti può essere raggiunto non solo nei nervi neonatale, ma anche nei nervi più maturi. Barre di scala = 200 micron (A); 50 micron (BE). Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione 11. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: Applicazione di elettroporazione in vivo (A) L'analisi al microscopio luce dello sviluppo di mielinizzanti SC.. nervo sciatico sono stati elettroporate con plasmide GFP che esprimono al P3, e sono stati fissati a vari stadi di sviluppo (P7, P14, P21 e P31). Immagini rappresentative della SC GFP-positive sono mostrati sulla sinistra. La lunghezza media e diametro sono riassunti come media ± SEM (n = 30-47 da 3 nervi) sulla destra. La lunghezza e il diametro mielinizzanti SCs aumenta al procedere dello sviluppo. (B) Un elettrone immagine al microscopio di un nervo sciatico trasfettate con un plasmide codificante LacZ. A transfettate SC (asterisco bianco, sinistra) è stato finemente etichettato con precipitati del prodotto di reazione β-galattosidasi. (C) L'immagine di una SC cotransfected con G-GECO1.1, un indicatore verde fluorescente citosolico Ca 2+, e R-GECO1mt, un indicatore rosso fluorescente mitocondriale Ca 2+. Le regioni all'interno dei bianchi rettangoli tratteggiate sono mostrati ampliata nei pannelli a destra. Barre di scala = 50 micron (A e C); 1 micron (B). Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione 11. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

In this paper, we describe a simple and efficient method that allows in vivo gene transfer to myelinating SCs in the rat sciatic nerve using electroporation. This method allows highly selective gene expression in myelinating SCs by simply applying electric pulses to the plasmid DNA-injected sciatic nerve. Because the molecular mechanisms of myelination and demyelination in the peripheral nervous system remain unclear, the present in vivo electroporation method will be a powerful tool to clarify the roles of multiple genes of interest in living animals.

A critical requirement of this method is to keep damage to the nerve during surgery to a minimal level. Should surgical damage cause excessive inflammation, the sciatic nerve may degenerate. To avoid this, one must conduct surgery with extreme care, so as to not damage the blood vessels around the nerve. Mechanical stress to the nerve during the surgery can also be a cause of nerve damage. To minimize mechanical stress, lifting the exposed nerve should be done as gently as possible, and the tweezer-type electrode should be placed close to the nerve without contact. Furthermore, electrical pulses that are too strong can cause undesirable large leg movement, which leads to mechanical stress, or can burn the nerve. If significant damages are observed in the nerves, we recommend reducing the electrical pulse intensities or placing the electrode further away from the nerve.

In our present protocol, CAG promoter-driven plasmids were used as expression vectors. CAG promoter-driven plasmids allow high levels of gene expression in myelinating SCs in vivo. We also have tried a CMV promoter, another widely used universal promoter for mammalian gene expression, but expression of the gene product was very weak. This is consistent with previous results, in which electroporation-mediated transfection was conducted in the embryonic brain20. Therefore, we recommend using CAG promoter-driven plasmids for the in vivo electroporation method.

Because axonal signaling is a key factor in myelination/demyelination21, gene modification in neurons is also important. However, delivery of transgenes using our in vivo electroporation method is limited to SCs. It has been reported that gene delivery into sciatic nerve axons can be achieved when in vivo electroporation is applied to dorsal root ganglion (DRG) neurons in adult rats22. This suggests that delivery of plasmid DNA to the cell body is likely to be critical for in vivo transfection of peripheral axons. Thus, to examine the involvement of axonal molecules in myelination/demyelination, researchers should use neuron-specific genetic methods such as genetically modified animals, neuron-specific viral vectors, or in vivo electroporation to DRG neurons.

Compared with current methods, such as the generation of genetically modified animal lines23 and delivery of transgenes by viral vectors4-6, gene modification of SCs by in vivo electroporation is simpler. This method only requires several days for plasmid DNA construction and one day for electroporation surgery. Plasmid DNA construction does not require a biohazard room that is usually essential for viral vector handling. In addition, one of the advantages of the electroporation method is the capacity for simultaneous expression of multiple gene products using a simple protocol. Our novel technique will be useful for analyzing the interaction of a variety of signaling molecules involved in myelination and demyelination. In particular, by permitting the cotransfection of a number of different intracellular fluorescent probes, our method should be a powerful tool for investigating intracellular signaling dynamics in SCs using live imaging experiments.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology to M.I. (21229004 and 25221304).

Materials

Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 03 143 422 001 Plasmid DNA purification kit
Fast Green CFC WAKO 069-00032 Dye for DNA injection
GC 150T-10 HARVARD APPARATUS 30-0062 Glass capillary
Suction tubing Drummond 05-2000-00 Suction tubing for micro injection
MODEL P-97 SUTTER INSTRUMENT CO. Micropipette puller
CUY21 Single Cell BEX Electroporator CUY21 Single Cell Pulse generator
Electric warmer KODEN CAH-6A Warmer during the surgery
Isofluolane Mylan 1119701G1076 Anesthetic
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Referências

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Ino, D., Iino, M. In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation. J. Vis. Exp. (115), e54567, doi:10.3791/54567 (2016).
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