JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Экспериментальная Заражение<em> листерий</em> В качестве модели для изучения хоста интерферон гамма ответов

Published: November 16, 2016
doi:
10.3791/54554
, , , ,
1Department of Immunology,University of Toronto, 2Toronto General Research Institute,University Health Network, 3Women’s College Research Institute

Summary

Этот протокол описывает , как прививают C57BL / 6J мышей штамма EGD из листерий (L. моноцитогенес) и для измерения интерферона-гамма (IFN-gamma) ответов на естественных киллеров (NK) клеток, естественных киллеров Т (НКТ) клеток, и адаптивным Т-лимфоциты после заражения. Этот протокол также описывает , как проводить исследования выживаемости у мышей после заражения с помощью модифицированного LD 50 дозы возбудителя.

Abstract

L. моноцитогенес является грамположительной бактерией , которая является причиной болезней пищевого происхождения в организме человека. Экспериментальная инфекция у мышей с этим патогеном является высокоинформативным о роли врожденной и адаптивной иммунных клеток и специфических цитокинов в хозяина иммунитета против внутриклеточных патогенов. Получение IFN-gamma врожденными клетками во время сублетального инфекции с L. моноцитогенес имеет важное значение для активации макрофагов и ранний контроль возбудителя 1-3. Кроме того, производство IFN-γ с помощью адаптивных лимфоцитов памяти имеет важное значение для заливки активации врожденного клеток на реинфекцией 4. L. моноцитогенес модель инфекции , таким образом , служит отличным инструментом для исследования , могут ли новые методы лечения, которые предназначены для увеличения производства IFN-gamma оказывают влияние на IFN-γ ответы в естественных условиях и имеют продуктивные биологические эффекты , такие как увеличение бактерий зазор или улучшение выживания мыши изинфекционное заболевание. Описанная здесь является базовым протоколом для того, как проводить внутрибрюшинные инфекции C57BL / 6J с штамма EGD от L. моноцитогенес и измерить продукцию IFN-gamma NK клетками, клетками NKT и адаптивное лимфоцитов при помощи проточной цитометрии. Кроме того, процедуры описаны в: (1) расти и готовить бактерии для инокуляции (2) измерения бактериальной нагрузки в селезенке и печени, а также (3) выживание мера животного к конечным точкам. Также предоставляются представительные данные для иллюстрации того, как эта модель инфекция может быть использована для проверки влияния специфических агентов на IFN-gamma ответов на L. моноцитогенес и выживаемости мышей от этой инфекции.

Introduction

ИФН-γ представляет собой цитокин , который имеет решающее значение для опосредования иммунитета против внутриклеточных патогенов и для контроля роста опухоли 5. Важность этого цитокина в бактериальной резистентности проявляется в наблюдении , что люди с мутациями в сигнальном пути IFN-гамма очень восприимчивы к инфекции с микобактериями и сальмонелл 6. Кроме того , у мышей с дефицитом либо IFN-gamma или IFN-γ дефектов рецептора выставляться в устойчивости к микобактерий 7-9 и других внутриклеточных патогенов , включая L. моноцитогенес 10,11, Лейшмания основная 12, Salmonella Typhimurium 13, и некоторые вирусы 11. В дополнение к борьбе с патогенами, IFN-γ играет решающую роль в принимающей обороны против опухолей 14. Хотя выше производство IFN-gamma является полезным в контексте инфекции или рака, длительное производство этого цитокина было связано тО развитии системного аутоиммунитете 15-17 и ускорения развития диабета типа I в не страдающих ожирением диабетической модели мыши 18.

Основными источниками IFN-gamma включают NK – клетки, клетки NKT, γδ Т – лимфоциты, хелперные 1 (Th1) клеток Т и цитотоксических Т – лимфоцитов (CTL) 5,19,20. IFN-γ повышает как врожденный и адаптивный иммунитет путем: (1) до регулирующего главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и выражение II, (2) увеличение экспрессии костимуляторных молекул на антиген-представляющих клеток, (3) повышение макрофагальной фагоцитоз и производство провоспалительных цитокинов и антимикробные факторы (например, оксид азота и активные формы кислорода), (4) содействие дифференцировки наивных CD4 + Т – клеток в эффекторные клетки Th1, (5) содействие переключения класса антител к иммуноглобулина ( Ig), 2a и IgG3 (у мышей), (6) индукции продуцирования хемокинов привлекать клетки иммунной системы к участкам Infection, и (7) повышение NK клеток и CTL ответов 5,19. Учитывая исключительную важность IFN-gamma в ответ хозяина к патогенам и опухолей, рекомбинантный IFN-γ была испытана в качестве лечения различных инфекций и злокачественных опухолей (обзор в 19). Тем не менее, так как системное введение IFN-gamma или Th1 способствующего цитокина интерлейкина-12 (IL-12) связано с побочными эффектами и от дозы токсичность 19,21, существует заинтересованность в разработке альтернативных стратегий для повышения IFN-γ производства путем иммунные клетки. Разработка новых биопрепаратов и малых молекул требуется в естественных условиях скрининговых инструментов для тестирования повышают ли такие средства производства IFN-gamma в ходе иммунного ответа и переводит ли это в значимые биологические эффекты , такие как повышение выживаемости животных.

Экспериментальная инфекция у мышей с грамположительной бактерии L. моноцитогенес была инструментальная модельрасшифровке роль IFN-gamma в хост-иммунитета против внутриклеточных патогенов 1,22. Заражение мышей с патогеном внутривенно или внутрибрюшинно (IP) приводит к быстрому распространению бактерий в селезенке и печени, где они становятся интернализованной резидентами макрофагов и гепатоцитов с пиковыми нагрузками бактерий в селезенке, происходящих от 3 до 4 дней пост- инфекция 1,3,22. Получение IFN-gamma NK клетками является важным для активации макрофагов и ранней устойчивости к возбудителю 3; Однако при высоких дозах инфекционных, производство IFN-gamma также может быть вредным для патогена зазор 23. НКТ – клетки также являются источником IFN-gamma в селезенке и печени во время раннего контроля патогенов 2,24 и это производство было показано, усиливает продукцию IFN-gamma другими типами клеток , включая клетки NK 2. С другой стороны, в дальнейшем действующие адаптивные Т – лимфоциты, CD8 + Т – клеток в Partiлярных, имеют важное значение для опосредования зазор возбудителя и обеспечивая защиту от повторного заражения 1,4,22.

Эта модель инфекции была привлекательной для исследователей по целому ряду причин (обзор 1). Во-первых, заражение патогеном является высокой воспроизводимостью и индуцирует сильную Th1 и клеточный иммунный ответ. Во-вторых, во время сублетального инфекции, бактериальной нагрузки концентрируется в печени и селезенке, где он может быть легко измерены. В-третьих, возбудитель может быть безопасно работать в соответствии с биологической безопасности 2-го уровня (BSL2) условиях. В-четвертых, организм и иммунный ответ, который он создает, были широко охарактеризованы. И, наконец, различные мутантные и генетически модифицированных штаммов были разработаны, которые доступны для использования.

Описанное здесь является основным протоколом для прививки C57BL / 6J с штамма EGD Л. моноцитогенес 25 и для измерения IFN – γ повторноН.К. ответах, НКТ и адаптивных лимфоцитов после инфицирования. Также описано , как измерять бактериальной нагрузки в селезенке и печени после сублетального инфекции и провести исследования выживаемости после инфицирования с модифицированной LD 50 дозы возбудителя. И, наконец, репрезентативные данные показаны как этот протокол может быть использован для скрининга влияния новых обработок на ответах IFN- и выживаемости мышей от L. моноцитогенес инфекции.

Protocol

Заявление по безопасности Этот протокол описывает заражение мышей с живыми моноцитогенес L.. Возбудитель обрабатывается безопасно в условиях BSL2 квалифицированным персоналом, не иммунодефицитом. Людей с ослабленным иммунитетом относятся беременные женщины, пожилы…

Representative Results

На рисунке 3 приведены некоторые типичные проточной цитометрии окрашивания IFN-gamma в селезенке NK и NKT клеток через 24 часа после заражения 10 5 КОЕ возбудителя. На этом рисунке также иллюстрирует стратегию стробирования для окрашивания панели , описанной в <s…

Discussion

Здесь мы опишем протокол о том , как проводить основную экспериментальную инфекцию штамма EGD из L. моноцитогенес 25 самок и самцов C57BL / 6J. Этот протокол был создан с целью изучения влияния нового малую молекулу IS001 на производство IFN-gamma врожденным и адаптивным лимфоцитов в ест…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

Materials

Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1xPBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaledehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS
10 x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 10x in ddH20
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 mL vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL6/J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 wks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes BD
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0-300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnositics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  30. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  31. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  32. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  33. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  34. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  35. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  36. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  37. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  38. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  39. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  40. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  41. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  42. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  43. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  44. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Tags

Listeria MonocytogenesExperimental InfectionInterferon GammaC57 Black MiceBacterial LoadSurvivalBHI AgarBHI BrothOD600PBSCentrifugationDilution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image