Rotulagem de anticorpos com corantes fluorescentes utilizando proteína Magnetic A e esferas de proteína G

Os anticorpos marcados com moléculas pequenas são, talvez, os reagentes mais utilizados na biologia ^1,2. Os anticorpos marcados com corantes fluorescentes e biotina são amplamente utilizados em imagiologia, imunoensaios, citometria de fluxo, Western blot, imunoprecipitação e entre outras aplicações ^3-6. Anticorpos radiomarcados ^3,7 encontrar o uso extensivo em imagiologia e terapia, anticorpos marcados com drogas citotóxicas (ADCs) estão oferecendo novas opções para o tratamento de cancros, e dois ADCs já foram aprovados para uso terapêutico ^8. Apesar de sua ampla utilização, os métodos para detecção de anticorpos rotulagem continuam surpreendentemente inalterado e normalmente envolvem múltiplas reações e dessalinização os passos ^9-12. métodos de solução funciona muito bem nos casos em que apenas alguns anticorpos necessita ser etiquetado e estão disponíveis em forma altamente purificada em concentração elevada e em volumes suficientes. No entanto, para aplicações mais recentes, como os ADCs, existe umprecisa para marcar anticorpos de hibridoma na fase precoce de modo que eles podem ser rastreados para propriedades biologicamente relevantes, por exemplo, mediada por receptor de anticorpos de internalização ^13-16. Na fase de hibridoma, os volumes de amostra são limitados, os anticorpos são expressas em baixas concentrações e uma série de amostras são grandes, portanto, solução baseada em métodos de marcação não são adequados.

Para simplificar e melhorar o rendimento dos métodos de rotulagem de anticorpos tradicionais, algumas abordagens alternativas têm sido propostas ^17,18. Uma abordagem é a utilização de proteínas de não-magnético grânulos de afinidade embalados em pequenas colunas para capturar anticorpos, seguido pela reacção de marcação e a eluição da proteína marcada e purificada. Este método pode ser utilizado para rotular os anticorpos directamente a partir de meios de células, no entanto, o uso de colunas pode ser trabalhoso. Processo baseado em esférulas magnéticas tem sido relatado recentemente que ¹⁹ elimina o uso de colunas e melhora o rendimento mas devidopara o anticorpo limitada capacidade dos grânulos de ligação, apenas a nanograma a baixas quantidades de micrograma de os anticorpos podem ser marcados.

Nós recentemente desenvolvido e utilizado alta capacidade magnética Proteína A e Proteína G grânulos (> 20 mg de IgG humana / mL de esferas de liquidados) para rotular anticorpos presentes nos meios de células com moléculas pequenas ^20. A elevada capacidade dos grânulos permite dezenas a centenas de microgramas de anticorpo a ser marcado convenientemente e a resposta magnética rápida dos grânulos simplifica o manuseamento e processamento de um grande número de amostras em paralelo. Utilizando corantes fluorescentes como substitutos para moléculas pequenas, que mostram que o método é compatível com a amina e tiol rotulagem química e oferece recuperações elevadas de anticorpos marcados e muito puras.

Este protocolo eo vídeo que a acompanha descrevem rotulagem on-gota de anticorpos de ratinho presentes nos meios de células usando G esferas de Proteína Magnetic A e proteína. O protocolo édividida em quatro secções: uma secção descreve a captura de anticorpos para o grânulo a partir de amostras biológicas. Após a captura, a rotulagem de anticorpos com corante fluorescente usando química amina ou utilizando a química do tiol é descrito nas Secções 2 e seção 3, respectivamente. Finalmente, a seção 4 descreve o método para o cálculo da concentração de anticorpos e o corante à relação de anticorpos.