磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

小分子で標識された抗体は、おそらく生物学^1,2で最も一般的に使用される試薬です。蛍光色素とビオチンで標識された抗体広範囲撮像に使用される、免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびその他のアプリケーション^3-6間の免疫沈降。放射性標識した抗体^3,7イメージングおよび治療 ​​における広範な使用を見出す、細胞毒性薬（のADC）で標識した抗体は、癌の治療に新たな選択肢を提供している、と2個のADCは、既に治療的使用の⁸のために承認されています。その広範な使用にもかかわらず、抗体を標識するための方法は、驚くほど変化しないままで、通常は複数の反応を伴い、脱塩が^{9-12ステップ}しています。解決方法は、わずか数抗体が標識される必要があり、高濃度で高度に精製された形態で利用可能である場合には、十分なボリュームで非常にうまく機能します。しかし、ADCのような新しいアプリケーションのために、そこにあります例えば、それらは生物学的に関連する特性についてスクリーニングすることができるように、初期のハイブリドーマ段階で抗体を標識する必要があり、受容体媒介性抗体の内在^13-16。ハイブリドーマ段階で、サンプル容量は限られている抗体が低濃度で発現され、サンプルの数は、従って、溶液ベースの標識方法は適していない、大きいです。

従来の抗体標識法のスループットを簡素化し、改善するために、いくつかの代替的なアプローチは^、17,18提案されています。一つのアプローチは、標識および精製されたタンパク質の標識反応と溶出した抗体を捕捉するために、非磁性タンパク質小さなカラムに充填親和性ビーズを使用することです。この方法は、細胞培地から直接抗体を標識するために使用することができるが、列の使用が面倒であることができます。磁気ビーズに基づく方法は、最近のカラムの使用を排除し、スループットが、原因を改善すること^19が報告されていますビーズの結合能力を制限された抗体には、抗体の低マイクログラム量にのみナノグラムを標識することができました。

我々は最近開発され、小分子²⁰と細胞培地中に存在する抗体を標識するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズ（落ち着いたビーズのヒトIgG / mlでの> 20 mg）を使用しました。ビーズの高容量は、抗体のマイクログラム数十〜数百が便利に標識することを可能にし、ビーズの迅速な磁気応答は、並列に多数のサンプルの取り扱いおよび処理を簡素化します。小分子の代替物として蛍光色素を使用して、我々は、この方法は、アミンおよびチオール標識化学と互換性があり、標識され、非常に純粋な抗体の高い回収率を提供していますことを示しています。

このプロトコルおよび付随するビデオは、磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いて細胞培地中に存在するマウス抗体のビーズ上の標識を説明します。プロトコルです4つのセクションに分かれて：第1節では、生物学的サンプルからビーズへの抗体の取り込みについて説明します。捕捉に続いて、アミン化学を用いて、またはチオール化学を用いて蛍光色素を有する抗体の標識は、それぞれ、セクション2およびセクション3に記載されています。最後に、セクション4は、抗体濃度の計算および抗体比染料のための方法が記載されています。