Antilichaam Labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische Proteïne A en Proteïne G Beads

Antilichamen gelabeld met kleine moleculen zijn misschien de meest gebruikte reagentia in de biologie ^1,2. Antilichamen gelabeld met fluorescente kleurstoffen en biotine worden veel gebruikt in de beeldvorming, immunoassays, flowcytometrie, Western blots, immuunprecipitatie en onder andere toepassingen ^3-6. Radiogelabelde antilichamen ^3,7 vinden veel toepassing bij beeldvorming en therapie, antilichamen gelabeld met cytotoxische geneesmiddelen (ADCs) bieden nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van kanker, en twee ADCs zijn reeds goedgekeurd voor therapeutisch gebruik ^8. Ondanks hun veelvuldig gebruik zijn de methoden voor het labelen van antilichamen verrassend ongewijzigd gebleven en meestal meerdere reacties te betrekken en ontzouting stappen ^9-12. Oplossing methoden werken heel goed in gevallen waar slechts een paar antilichamen moeten worden geëtiketteerd en zijn verkrijgbaar in zeer gezuiverde vorm bij hoge concentratie en in voldoende volumes. Voor nieuwere toepassingen zoals ADC, is er eenmoeten antilichamen etiketteren vroeg stadium hybridoma zodat ze kunnen worden gescreend op biologisch relevante eigenschappen, bijvoorbeeld receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam ^13-16. Voor deze hybridoma stadium monstervolumes beperkt, antilichamen uitgedrukt bij lage concentraties en een aantal monsters zijn groot, dus oplossing gebaseerde labeling niet geschikt zijn.

Ter vereenvoudiging en verbetering van de doorvoer van de traditionele labeling antilichamen gebaseerde methoden, hebben een aantal alternatieve benaderingen voorgesteld ^17,18. Een benadering is niet-magnetische proteïne A gebruikt affiniteitskorrels verpakt in kleine kolommen antilichamen gevolgd door de labelingsreactie en elutie van gelabelde en gezuiverd eiwit vangen. Deze methode kan worden gebruikt om antilichamen direct labelen van cel media, is het gebruik van kolommen moeizaam. Een magnetische korrel gebaseerde werkwijze is recentelijk gerapporteerd dat ¹⁹ het gebruik van kolommen elimineert en verbetert de doorvoer maar doorde beperkte antilichaambinding capaciteit van de korrels konden alleen lage nanogram tot microgram hoeveelheden van de antilichamen worden gelabeld.

We hebben onlangs ontwikkeld en gebruikt hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels (> 20 mg humaan IgG / ml vaste korrels) antilichamen aanwezig in celmedium met ²⁰ kleine moleculen te labelen. De hoge capaciteit van de korrels maakt tientallen tot honderden microgram antilichaam gemakkelijk worden gemerkt en de snelle respons van de magnetische kralen vereenvoudigt behandeling en verwerking van een groot aantal monsters in parallel. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, laten we zien dat de methode is compatibel met de etikettering chemie amine en thiol en biedt een hoge terugvorderingen van gemerkt en zeer zuiver antilichamen.

Dit protocol en de bijbehorende video beschrijven on-bead etikettering van muizenantilichamen in de cel media met magnetische Proteïne A en Proteïne G parels. Het protocol isverdeeld in vier delen: Deel 1 beschrijft de verovering van antilichamen op de hiel van biologische monsters. Naar aanleiding van capture, wordt de etikettering van antilichamen met een fluorescerende kleurstof met behulp van amine chemie of met behulp van thiol chemie beschreven in rubriek 2 en deel 3, respectievelijk. Tenslotte worden in hoofdstuk 4 beschrijft de werkwijze voor de berekening van de antilichaamconcentratie en de kleurstof antilichaam verhouding.