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Ambiente

La extracción de sustancias poliméricas extracelulares estructural de lodo granular aerobio

Published: September 26, 2016
doi:
10.3791/54534
, , , ,
1Department of Biotechnology,Delft University of Technology, 2Department of Biotechnology, Norwegian Biopolymer Laboratory (NOBIPOL),Norwegian University of Science and Technology

Summary

El protocolo proporciona una metodología para solubilizar lodo granular aeróbico con el fin de extraer los polímeros extracelulares de alginato-como (ALE).

Abstract

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Introduction

En los últimos años, el proceso aerobio lodo granular (AGS) se ha convertido en un proceso de tratamiento biológico de aguas residuales popular, aplicado con éxito en varias plantas de tratamiento de aguas residuales a escala real 1. En contraste con el proceso de lodos activados convencional, en el proceso de los AGS los microorganismos forman gránulos en lugar de flóculos 2. Estos gránulos tienen mejor decantación, son capaces de soportar velocidades de carga orgánica más altas, y tienen una mayor tolerancia a la toxicidad de los flóculos de lodo activado 3.

A diferencia de las biopelículas, AGS se forma de manera espontánea y sin la participación de cualquier material de soporte 4. En AGS, como en biopelículas, los microorganismos producen una cantidad significativa de sustancias poliméricas extracelulares altamente hidratados (EPS) 5 para formar una matriz de hidrogel en la que son auto-inmovilizado 4-6. EPS son una mezcla compleja, que consta de polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos, (phospho) lípidos, sustancias húmicas y algunos polímeros intercelulares 5,7,8. Estas sustancias poliméricas interactúan entre sí a través de fuerzas electrostáticas, enlaces de hidrógeno, fuerzas iónicas atractivos y / o reacciones bioquímicas, etc. 5, formando una estructura de red terciaria densa y compacta. Los polímeros en EPS que son capaces de formar hidrogeles 4,9 y contribuir a la formación de la estructura de la red terciaria son a este respecto considerado como EPS estructurales, un subconjunto de los EPS totales.

EPS son responsables de la estructura química y propiedades físicas de los gránulos 5. Por lo tanto, es crucial para entender la función de cada compuesto EPS. Diversos enfoques se aplican para extraer EPS 10-15. Sin embargo, debido a su extrema complejidad, es casi imposible de extraer todos los componentes del EPS por un solo método. Hasta la fecha, no existe una "talla única" método para la extracción de EPS. La elección del método de extracción influye no sólo la cantidad total, sino también la composición de los polímeros recuperados 13,16 – 20. Dependiendo del tipo de lodo y las ganancias por acción de interés diferentes métodos son obligatorios.

La extracción de los polímeros formadores de gel, la caracterización de sus propiedades y la investigación de sus interacciones con los demás y con EPS no formador de gel ayudará a revelar el papel de EPS en la formación de lodo granular aerobio. Además, los polímeros formadores de gel son también biopolímeros útiles en aplicaciones industriales. Una posible aplicación ya se demostró mediante el uso de polímeros formadores de gel de AGS como material de recubrimiento para aumentar la resistencia al agua de papel 21.

Por lo tanto, se necesitan métodos de extracción, específicos para EPS formadores de gel. El objetivo de este estudio es desarrollar una metodología para extraer EPS de formación de gel de AGS. Seis métodos de extracción 10 – 15,22, que se utilizan con frecuencia en la literatura, se seleccionaron para extraer EPS de la AGS. La cantidad total y la propiedad de formación de gel de la EPS extraídos se compararon para cada metodología.

Protocol

NOTA: AGS se recogió del reactor piloto Nereda en la planta de tratamiento de aguas residuales de Utrecht, Holanda. El reactor se alimenta con las aguas residuales municipales. El lodo granular tenía un índice de volumen de fangos (SVI 5min) de 59,5 ml / g de VSS. El lodo se tomaron muestras en abril al final de un ciclo aeróbico. Después del muestreo, el lodo se transporta inmediatamente al laboratorio, se tamizó y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. 1. Extracción EPS NOTA: Centrífuga lodo granular en 4000 × g y 4 ° C durante 20 min, y decantar el sobrenadante. Recoger gránulos en el pellet para las extracciones. Los sólidos totales (TS) y los sólidos volátiles (VS) de los gránulos se determinaron mediante los métodos estándar 23. El factor de conversión entre el peso húmedo de gránulos – el peso de los gránulos tomadas directamente de la pastilla – y de la TS se determinó antes de la extracción. Todas las extracciones se realizaron por triplicado. NOTA: 3 g g húmedaranules se utilizaron para cada método de extracción. Sus TS y los valores VS (0,39 g TS y 0,34 g VS), medidos por triplicado, se utilizaron para calcular el rendimiento de extracción. Extracción de centrifugación 11 Transferencia de 3 g (peso húmedo) de gránulos en un tubo de centrifugación y llenar el tubo de centrifugación a 50 ml con agua desmineralizada. sacudir ligeramente el tubo de centrifugación con la mano. Centrifugar el tubo de centrifugación que contiene la mezcla a 4000 x g y 4 ° C durante 20 min. Recoger el sobrenadante en un vaso de vidrio, desechar el sedimento y continuar con el sobrenadante como se describe en la sección 1.7. Extracción de sonicación 10 Transferencia de 3 g (peso húmedo) de gránulos en un tubo de centrifugación y llenar el tubo de centrifugación a 50 ml con agua desmineralizada. Aplicar sonicación por impulsos en hielo durante 2,5 min a 40 W a la mezcla. Centrifugar la centrifugacióntubo que contiene la mezcla a 4000 x g y 4 ° C durante 20 min. Recoger el sobrenadante en un vaso de vidrio, desechar el sedimento y continuar con el sobrenadante como se describe en la sección 1.7. Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de extracción 11 Transferencia de 3 g (peso húmedo) de gránulos en una botella de vidrio de 100 ml y llenar la botella a 50 ml con 2% (w / v) de solución de EDTA. sacudir ligeramente la botella con la mano y almacenarlo en el refrigerador a 4 ° C durante 3 horas. Transferir la mezcla en un tubo de centrifugación de 50 ml. Centrifugar el tubo de centrifugación que contiene la mezcla a 4000 x g y 4 ° C durante 20 min. Recoger el sobrenadante en un vaso de vidrio, desechar el sedimento y continuar con el sobrenadante como se describe en la sección 1.7. Formamida – extracción de hidróxido de sodio (NaOH) 13 Transferencia de 3 g (peso húmedo) de los gránulos en un 100botella de vidrio ml y llenar la botella de 50 ml con agua desmineralizada. Añadir 0,3 ml 99% de formamida. sacudir ligeramente la botella con la mano y almacenarlo en el refrigerador a 4 ° C durante 1 hora. Añadir 20 ml de NaOH 1 M a la suspensión de gránulos. sacudir ligeramente la botella con la mano y almacenarlo en el refrigerador a 4 ° C durante 3 horas. Transfiera la mezcla uniformemente en dos de 50 ml tubo de centrifugación. Centrifugar los tubos de centrifugación que contienen la mezcla a 4000 x g y 4 ° C durante 20 min. Recoger el sobrenadante en un vaso de vidrio, desechar el sedimento y continuar con el sobrenadante como se describe en la sección 1.7. Extracción de NaOH 11 – formaldehído Transferencia de 3 g (peso húmedo) de gránulos en una botella de vidrio de 100 ml y llenar la botella hasta 50 ml con agua desmineralizada. Añadir 0,3 ml de formaldehído al 37%. sacudir ligeramente la botella con la mano y almacenaren el refrigerador a 4 ° C durante 1 hora. Añadir 20 ml de NaOH 1 M a la suspensión de gránulos. sacudir ligeramente la botella con la mano y almacenarlo en el refrigerador a 4 ° C durante 3 horas. Transfiera la mezcla uniformemente en dos de 50 ml tubo de centrifugación. Centrifugar los tubos de centrifugación que contienen la mezcla a 4000 x g y 4 ° C durante 20 min. Recoger el sobrenadante en un vaso de vidrio, desechar el sedimento y continuar con el sobrenadante como se describe en la sección 1.7. Alta temperatura – la extracción de carbonato de sodio (Na 2 CO 3) 9,22,24 Pre-calor 150 ml agua del grifo en un vaso de precipitados de vidrio 1000 ml en un agitador magnético a 80 ° C. Transferencia de 3 g (peso húmedo) de gránulos en un 250 ml con deflectores matraz y llenar el matraz de 50 ml con agua desmineralizada. Añadir 0,25 g de Na 2 CO 3 anhidra o 0,67 g de Na 2 CO 3 • 10H <sub> 2 O en el matraz para obtener un 0,5% (w / v) Na 2 CO 3 concentración. Poner el matraz que contenía la mezcla en el baño de agua. Cubrir el frasco y el vidrio vaso de precipitados separado con papel de aluminio para evitar la evaporación. Se agita la mezcla durante 35 min a 400 rpm y 80 ° C. Transferir la mezcla en un tubo de centrifugación de 50 ml. Centrifugar el tubo de centrifugación que contiene la mezcla a 4000 x g y 4 ° C durante 20 min. Recoger el sobrenadante y desechar el sedimento. TS y VS medición de todos los extractos de acuerdo con los métodos estándar 23. Tome el sobrenadante y se dializa durante 24 horas frente a 1.000 ml de agua ultrapura (bolsa de diálisis con 3.500 Da de peso molecular de corte (MWCO)) 11,12. Cambiar el agua de diálisis después de 12 hr para mejorar el efecto de la diálisis. Transferir una fracción razonable (alrededor de 1/3) del sobrenadante se dializó aun plato de aluminio para TS y VS 23 de medición. NOTA: Se seca la muestra durante la noche a 105 ° C. La diferencia de peso de la cápsula de aluminio vacío y el plato de aluminio que contiene la muestra seca es el contenido TS. A continuación, grabar el mismo plato de aluminio que contiene la muestra a 550 ° C durante 2 hr. La diferencia de peso entre el plato de aluminio vacío y el plato de aluminio que contiene la muestra quemada es el contenido de cenizas. La diferencia entre el contenido de TS y la ceniza es el contenido VS. Para cada extracto, la transferencia de la fracción residual del sobrenadante se dializó a 10 vasos de precipitados de vidrio ml. Espesar el sobrenadante durante 2 días a 60 ° C hasta un volumen final de 1-2 ml para aumentar la concentración de polímero en el sobrenadante. 2. El alginato-como extracelular Polímero (ALE) Extracción Se dializa el extracto obtenido en el paso 1.6.8 según la etapa 1.7.1. Transferir el extracto dializado en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml. Lentoly se agita la extracción a 100 rpm y la temperatura ambiente. Constantemente monitorear los cambios de pH con un electrodo de pH, mientras que la adición de ácido clorhídrico 1 M (HCl) a un pH final de 2,2 ± 0,05 para obtener ALE en la forma ácida. Después de ajustar el pH a 2,2, transferir el extracto en un tubo de centrifugación de 50 ml y se centrifuga a 4000 × g y 4 ° C durante 20 min. Descartar el sobrenadante y recoger el precipitado de tipo gel. El sedimento de tipo gel es ALE en forma ácida. Para obtener la forma de ALE de sodio (o de potasio), se añade lentamente NaOH 0,5 M (o hidróxido de potasio 0,5 M) para el gel obtenido en la etapa 2.4, mientras que se mezcla el gel lentamente con una varilla de vidrio con la mano hasta que se alcanza pH 8,5. 3. prueba de formación de hidrogel Ionic NOTA: Con el fin de comprobar si las EPS extraídos tenían propiedades de formación de hidrogel iónicos, una prueba de formación de perlas con iones Ca2 + se utilizó 25. Después de espesamiento del extracto en el paso 1.7.3 aun volumen de 1-2 ml, mezclar lentamente la mezcla con una varilla de vidrio y ajustar su pH a 8,5 con NaOH 0,5 M. Tome el extracto de la etapa 3.1 o la ALE de sodio de la etapa 2.5 y lentamente por goteo el extracto con una pipeta Pasteur en un 2,5% (w / v) de cloruro de calcio (CaCl 2) solución. NOTA: Si el EPS se extrae tiene gel de hidrogel iónico propiedades de formación, en forma de gota se formó (esféricas) perlas. Si el EPS extraída no tiene gel de hidrogel iónico propiedades de formación, el extracto se dispersará en la solución de CaCl2. 4. Prueba de estabilidad de la iónico de hidrogel NOTA: Para entender aún más el papel del hidrogel EPS iónicos en la formación de estructura de AGS, las pruebas de estabilidad se realizaron en las perlas de hidrogel iónicos de la Na 2 CO 3 de extracción, recogidos en el paso 3.2. Mantener las perlas de hidrogel de 30 min en la solución de CaCl 2. Use una cuchara para sacar las perlas de hidrogel de la CaCl2 </sub> solución y se separaron las perlas en cuatro fracciones iguales. fracción tienda 1 en 10 ml de agua desmineralizada durante 4 horas a 4 ° C. Las siguientes pruebas de estabilidad se llevaron a cabo de la misma manera como se describe en los métodos de extracción de 1,3 – 1,5. fracción de la tienda 2 en 10 ml 2% (w / v) de solución EDTA durante 3 horas a 4 ° C. fracción tienda 3 en 7,15 ml de agua desmineralizada con 60 l 99% de formamida durante 1 hora a 4 ° C. A continuación, añadir 2,85 ml de NaOH M 1 y almacenar la fracción 3 durante 3 horas a 4 ° C. fracción tienda 4 en 7,15 ml de agua desmineralizada con 60 l 37% de formaldehído durante 1 hora a 4 ° C. A continuación, añadir 2,85 ml de NaOH M 1 y almacenar la fracción 4 durante 3 horas a 4 ° C. Monitor Si no es visible la desintegración de los gránulos durante el almacenamiento en las condiciones descritas en 4.3 a 4.6 para evaluar si las perlas de soportar las condiciones de extracción.

Representative Results

extracción de EPS El aspecto de los gránulos después de aplicar diferentes procedimientos de extracción EPS se muestra en la Figura 1. La forma y estructura de gel de gránulos estaban intactos después de la centrifugación (Figura 1a) y la extracción con EDTA (Figura 1c). Los gránulos se rompen en fragmentos de diferentes tamaños por sonicación. La turbidez en la fase líquida podría ser debido a la suspensión de fragmentos pequeños (Figura 1b) como el turbidez altamente disminuyó después de la centrifugación. La formamida y formaldehído sí solo no tiene ningún impacto en el cambio de la forma de gránulo y su estructura de gel (datos no mostrados). Después de la adición de NaOH, la fase líquida se volvió amarillenta. Parte del material esponjoso se desprende de la superficie de los gránulos y se formó una capa en la parte superior de los gránulos coloca (Figura 1d y 1e). Sin embargo, la forma de lagránulos no se cambió. La adición de NaOH aparentemente mejoró EPS solubilización, pero no podría dañar la estructura de la matriz de gel. En comparación, los gránulos desaparecieron por completo después de Na 2 CO 3 de extracción (Figura 1F). En su lugar se forma una mezcla de partículas gelatinosas líquidos y minúsculas sol-como, que muestra la matriz de gel de gránulos de hecho fue solubilizado. Figura 1. aeróbicos lodo granular EPS extracciones. Para una mejor visualización del impacto de cada método de extracción sobre los gránulos, los experimentos se llevaron a cabo en 25 ml botellas de vidrio. Después de que el procedimiento de extracción, los extractos se mantuvieron durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que la materia en suspensión se asiente. (A) la extracción de la centrifugación, (b) extracción de sonicación, (c) extracción de EDTA, (d) formamida – NaOH adicionalcción, (e) El formaldehído – extracción de NaOH, (f) de alta temperatura -. Na 2 CO 3 extracción Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Rendimiento EPS con respecto a la fracción de VS para cada método se ilustra en la Figura 2. El rendimiento se presenta en mg VS EPS por g inicial VS gránulo. La cantidad de EPS obtenidos por formaldehído + NaOH, formamida + NaOH y Na 2 CO 3 + calor + mezcla fue mayor que la de la centrifugación, sonicación y la extracción de EDTA. Resultados similares para estas técnicas de extracción también se demostró por estudios anteriores 11 – 13,15 indican que las condiciones alcalinas mejorar la solubilidad EPS 26,27. La cantidad de EPS recuperada por Na 2 CO 3 fue la más alta, más de 20 veces de la que se obtiene solamente por centrifugación. Además, el rendimiento total de la EPS Na 2 CO 3 de extracción se puede mejorar aún más por múltiples extracciones. Una segunda extracción usando el sedimento descartado en el paso 1.6.8 (servicio de protocolo) de la primera extracción aumenta el rendimiento total en un 28%, una extracción cuádruple incluso aumentó el rendimiento total en un 46%. Figura 2. Resultados de los métodos de extracción con respecto al rendimiento de VS y contenido de cenizas. Para cada extracción, la primera barra representa el rendimiento en mg VS VS EPS por g inicial VS gránulo. La segunda barra representa el porcentaje en peso de cenizas en los TS extraídos. Las barras de error muestran la desviación estándar de las tres extracciones realizadas para cada técnica de extracción."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Alginato-como polímero extracelular de extracción (ALE) Después de que el pH de los EPS extraídos por el Na 2 CO 3 extracción se ajustó a 2,2, se precipitó 63% del VS total. El precipitado es ácida ALE 25. La fracción residual era probable EPS que se pueden solubilizar en las condiciones de extracción, pero no puede formar un precipitado a pH 2,2. Prueba de formación de hidrogel iónica gránulos aerobios se han descrito como siendo similar a un hidrogel. El proceso de granulación se ha considerado como un fenómeno de formación de gel con glucósidos como el agente gelificante 4,9,25,28. Normalmente, Ca 2+ es uno de los cationes más comunes en las aguas residuales. Además, fácilmente se une con polisacáridos ácidos (por ejemplo,alginatos y ácido poli-galacturónico), presumiblemente como un contraión para mediar la gelificación 29. Por lo tanto resulta en un hidrogel iónicamente reticulado. Se observó que la adición de iones de Ca 2+ puede acelerar granulación lodo aeróbico 30. Por lo tanto, Ca 2+ del EPS (hidrogel iónico) podrían desempeñar un papel importante en la construcción de la estructura de la matriz de gel de lodo granular aerobio. A este respecto, si las EPS extraídos forma un hidrogel iónico con iones de Ca2 + podría ser utilizado como una prueba para comprobar si el EPS extraído es un polímero estructural que contribuye a la formación de la matriz de gel en el lodo granular aeróbico 9. En esta investigación, por las EPS extraídos de AGS (Figura 3a) mediante diversos métodos, sólo la EPS extraídos por Na 2 CO 3 a cabo la forma de una gota en 2,5% (w / v) de solución de CaCl2 y formaron perlas de hidrogel iónicos estables .Por otra parte, la ALE de sodio obtenido de esta EPS por pasos adicionales (ALE extracción de polímero, Figura 3b) muestra la misma propiedad también. El color y la morfología de las perlas de gel -ALE Ca 2 + (Figura 3C) son similares a lodo granular aeróbico (Figura 3a). Al parecer, los EPS extraídos por el Na 2 CO método 3 contribuye a la formación de la matriz de gel en lodo granular aeróbico. ALE, que es un componente principal de este EPS son polímeros estructurales, capaz de formar un hidrogel iónico. Prueba de estabilidad del hidrogel iónica Se observó que durante la extracción EPS, aeróbicos gránulos mantuvieron su forma esférica en EDTA, formaldehído + NaOH y formamida + NaOH (Figura 1). Con el fin de comprender si los polímeros estructurales extraídos juegan un papel en la estabilidad de los gránulos, Ca 2+ -ALE perlas setratada exactamente de la misma manera como gránulos aerobios durante la extracción. Curiosamente, Ca 2+ perlas -ALE muestran las estabilidades similares a la de AGS (Figura 3D – 3F), es decir, Ca 2 + -ALE perlas eran extremadamente estable en EDTA. Hubo poca cantidad de ALE separado de la superficie de los granos de Ca 2 + -ALE (pequeños flóculos de color marrón en la Figura 3e y 3f), cuando los Ca 2+ -ALE perlas se habían empapado en formaldehído + NaOH y formamida + NaOH durante tres horas , respectivamente. Esta similitud en términos de estabilidad entre Ca2 + perlas -ALE y gránulos aerobios ALE indica que son una parte de los polímeros estructurales importantes que forman la matriz de gel AGS. Figura 3. gránulos aerobios y ALE extraído. (A) gránulos en agua desmineralizada prextracción ior. (B) ALE ácido (extraído de acuerdo con los párrafos 1.6 y 2) después de la centrifugación a 4000 x g y 4 ° C durante 20 min. Los resultados de la prueba de estabilidad del hidrogel iónico. (C) de Ca2 + -ALE-cuentas almacenadas en agua desmineralizada durante 4 horas a 4 ° C. (D) de Ca2 + -ALE-cuentas almacenadas en EDTA 2%, durante 3 horas a 4 ° C. (E) Ca 2+ -ALE-cuentas almacenadas en formamida + NaOH durante 4 horas a 4 ° C. (F) Ca 2+ -ALE-cuentas almacenadas en formol + NaOH durante 4 horas a 4 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Observaciones para el servicio de protocolo
La extracción de EPS / ALE se describe, por un volumen de 50 ml y 3 g de gránulos. Estos valores son guías. Extracciones con concentraciones más altas de los gránulos pueden disminuir el rendimiento de la EPS extraídos. Durante la extracción de ALE la temperatura debe mantenerse constante a 80 ° C durante 30 min. El tiempo requerido para la mezcla para calentar (alrededor de 5 min) se incluye en el protocolo. Además, la eficacia de extracción se mejora mediante el uso de una barra de agitación magnética de la mismo tamaño que el diámetro de la parte inferior del matraz. Esto dará lugar a buenas propiedades de mezcla y efectos de fresado, la promoción de la extracción de EPS.

Más adelante, en la sección de protocolo, se determinan TS y VS rendimientos de todas las extracciones (sobrenadante recogido en los pasos 1.1-1.6). La diálisis se debe realizar antes de la TS y VS medición para disminuir los posibles errores debido a la presencia de productos químicos utilizados para las extracciones. UNMWCO de 3.500 Da Se recomienda eliminar estas sustancias químicas al tiempo que conserva las macromoléculas EPS dentro de la bolsa de diálisis. La bolsa de diálisis debería tener un volumen mayor que el volumen del extracto. Esto es necesario, ya que el volumen del extracto se incrementará durante la diálisis (por ejemplo, para la extracción de EDTA hasta aumento de volumen 40%). El grado de eliminación química por diálisis se puede determinar midiendo el pH en la muestra antes y después de la diálisis. Alternativamente, las mediciones de conductividad del agua de diálisis muestran el grado de eliminación de iones.

Para obtener ALE de las EPS total extraído (pasos 1.6 y 2) la etapa de diálisis es opcional. Sin embargo, la diálisis tiene tres ventajas: reduce la cantidad de HCl necesaria para la precipitación, se mejora la transferencia de masa de ácido en el extracto y disminuye el contenido de cenizas de la ALE obtenido. Para la precipitación de ALE se recomienda usar un vaso de precipitados de vidrio con un volumen mucho mayor que la extract. Na 2 CO 3 sobredosis se presenta normalmente en la extracción. El HCl añadido será primero reaccionar con el Na 2 CO 3 dejó en el extracto, lo que resulta en la formación de dióxido de carbono y, si la muestra no se dializó antes, en la formación de espuma. Durante la adición del HCl, el extracto debe agitó lentamente con una barra de agitación magnética de el mismo tamaño que la parte inferior del vaso de precipitados. Una barra de agitación de este tamaño y agitación lenta dará lugar a una mezcla uniforme sin romper la estructura del precipitado. Si grumos de gel de ácidos se forman en el extracto, el vaso de precipitado debe ser agitado ligeramente con la mano. La precipitación se lleva a cabo con una concentración de ácido de 1 M de evitar un aumento de volumen grande del extracto mientras que todavía obtener una distribución homogénea del ácido en la muestra. las concentraciones de ácido más altas pueden dar lugar a una formación de disminución del pH regional y grumos de gel de ácidos. Un pH inferior a 2,0 disminuye la cantidad de ALE que se puede recuperar, probablemente debido a los cambios estructuralesde los polímeros a pH más bajo. Por tanto, es importante mantener el pH final en 2,20 ± 0,05.

limitaciones
El método de extracción ALE pretende extraer polímeros extracelulares estructurales de las EPS desde AGS o biopelículas en general y no tiene la intención de extraer todas las EPS presentes. Para extraer todos EPS, una combinación de más de un método de extracción es necesario. Por otra parte, como se muestra con el aumento del rendimiento VS EPS mediante la aplicación de una extracción doble y cuádruple, una sola extracción no extraer todos EPS estructurales. extracción ALE es un método de extracción EPS duro, la combinación de mezcla constante con las condiciones de calor y alcalinas. Por esta razón es posible que un poco de material intracelular se extrae junto con los EPS. Aunque la lisis celular puede ser causada por técnicas de extracción física y química (tratamiento con ultrasonidos, 31,32 NaOH 31,32, 11,32 EDTA, CER 32, 32 de calor y de alto cizallamiento tasas por mijación 19), la presencia de material intracelular en EPS recuperadas todavía tiene que ser verificado. La propiedad iónica de formación de gel de la EPS extraídos es el foco principal de esta investigación, si la EPS recuperada contiene material intracelular no fue analizado. La investigación futura se centrará en la identificación de material intracelular en la EPS extraídos.

Solubilización de la matriz de hidrogel de AGS es crucial para extraer EPS estructurales
EPS forma una matriz de hidrogel denso y compacto en AGS. Aunque EPS contiene diversas clases de macromoléculas orgánicas, tales como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos (fosfo), sustancias húmicas y algunos polímeros intercelulares 7,5,8, no todos ellos formar un gel. Sólo aquellos polímeros formadores de gel se consideran aquí como polímeros estructurales en EPS.

El objetivo de EPS extracciones es para solubilizar primera EPS y luego para recoger las EPS solubilizadas. Si la EPS estructurales (es decir, tél EPS formar un hidrogel) es el objetivo de la extracción, la matriz de gel de AGS tiene que solubilizarse primero. Sólo los métodos que pueden solubilizar la matriz de gel son capaces de extraer EPS estructurales. En esta investigación, algunos utilizan con frecuencia EPS métodos de extracción tales como centrifugación de 10 – 15, 10,14,15 sonicación, EDTA 10 – 12,14,15, formaldehído + NaOH al 10 – 15 y el formamida + NaOH 13 no pudieron aislar eficazmente el estructural EPS. Esto es debido al hecho de que la matriz de hidrogel de los gránulos aerobios no se solubilizó mediante estos métodos. Por esta razón, las pruebas de estabilidad en la sección 4 solamente se realizaron con las condiciones actuales de EDTA, formamida NaOH + y + formaldehído extracción de NaOH. Estos tres extracciones no eran capaces de aislar EPS estructurales, pero aún así obtener el mayor rendimiento VS EPS además de la Na 2 CO 3 de extracción. condiciones of Na 2 CO extracción 3 no se aplica ya que este método de extracción claramente solubilizan la matriz AGS. De ahí que las condiciones aplicadas durante la prueba de estabilidad se consideraron representativas.

La extracción con resina de intercambio catiónico (CER), otro método de extracción EPS utilizado con frecuencia, no se consideró para esta comparación, ya que los estudios anteriores sobre la extracción de EPS con CER no dió mejores resultados que las extracciones químicas que se utilizan aquí.

Gel de formación de EPS en AGS
EPS formadores de gel son considerados como los EPS estructurales en la matriz de hidrogel de AGS. Vale la pena señalar que hay varios tipos de hidrogeles tales como geles iónicos, geles inducidos por la temperatura y geles pH inducidos. Este estudio sólo se centra en EPS que forman geles iónicos. En cuanto a la gran fracción de material de gel estructural extraídos, esto es probable que sean los EPS estructurales dominantes. Es cierto que hay posibilidades de que otros tipos de EPSque forma diferentes tipos de hidrogeles (gel inducida por ejemplo, pH 28) existe en el mismo u otro tipo de gránulos aerobios. Sin embargo, no importa qué tipo de hidrogel se dirige, la solubilización de la matriz de gel de EPS es el paso más importante para extraer EPS formadores de gel.

Actualmente, la investigación se ha realizado sobre EPS estructurales de lodo granular. La extracción ALE se describe en este protocolo es capaz de extraer EPS de formación de gel de AGS y se utilizará en futuros estudios para caracterizar EPS estructurales. Más investigación que hay que hacer en AGS, EPS EPS estructurales y no estructurales para comprender mejor el proceso y la función de granulación y EPS. Especialmente los tres puntos siguientes deben ser investigados: ¿por qué microorganismos producen una cantidad tan grande de EPS, ¿cuál es la composición exacta de EPS y cómo es la composición de EPS modificado en función de los cambios ambientales. Detección y análisis de todos los compuestos involucrados y sus interactions ayudará a entender las biopelículas y la forma de utilizarlos a nuestro favor.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.

Materials

250 ml baffled flask Kimble 25630-250
1000 ml glass beaker VWR 213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer IKA 3810000
sodium carbonate decahydrate Merck KGaA 1063911000
50 ml centrifugation tubes greiner bio-one 227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge Heraeus/Thermo Scientific –
hydrochloric acid, 37 % Sigma-Aldrich 30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker VWR 213-1124
calcium chloride dihydrate Merck KGaA 1023821000
1 ml Pasteur Pipette Copan 201C
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Referências

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Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C., Lin, Y. M. Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge. J. Vis. Exp. (115), e54534, doi:10.3791/54534 (2016).
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