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Ambiente

에어로빅 세분화 된 슬러지에서 구조 세포 외 고분자 물질의 추출

Published: September 26, 2016
doi:
10.3791/54534
, , , ,
1Department of Biotechnology,Delft University of Technology, 2Department of Biotechnology, Norwegian Biopolymer Laboratory (NOBIPOL),Norwegian University of Science and Technology

Summary

프로토콜은 알긴산과 같은 세포 외 중합체 (ALE)를 추출하기 위해 호기성 입상 슬러지를 가용화하는 방법을 제공한다.

Abstract

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Introduction

최근에는 호기성 입상 슬러지 (AGS) 프로세스가 성공적으로 여러 본격적인 폐수 처리장 1인가 인기 생물학적 폐수 처리 공정이되고있다. 종래의 활성 슬러지 공정 달리, AGS이 과정에서 미생물 대신 플록 (2)의 과립을 형성한다. 이 과립, 더 나은 침강성이 높은 유기 로딩 속도를 견딜 수 및 활성 슬러지 플록 3보다 독성이 더 높은 내성을 가질 수 있습니다.

생물막 달리 AGS 자발적으로 어떤 담체 물질 (4)의 개입없이 형성된다. 6 – AGS에서 생물막 같은 미생물들은 자기 고정화 4 된 하이드로 겔 매트릭스를 형성하기 위해 고도로 수화 세포 외 폴리머 물질의 상당량 (EPS) (5)를 생성한다. EPS은 다당류, 단백질, 핵산으로 구성된 (phosp 복잡한 혼합물이다호) 지질, 휴믹 물질 및 일부 세포 간 고분자 5,7,8. 이러한 고분자 물질은 치밀하고 조밀 급 네트워크 구조를 형성하는 등의 오 정전기력, 수소 결합, 이온 매력적인 힘 및 / 또는 생화학 적 반응을 통해 서로 상호 작용한다. 하이드로 -4,9- 형성하고 급 네트워크 구조의 형성에 기여할 수있는 EPS의 중합체 구조 EPS 총 EPS의 부분 집합으로 간주이 점에있다.

EPS 화학 구조 및 입자 (5)의 물리적 특성에 대한 책임이있다. 각 EPS 화합물의 기능을 이해하는 것이 중요하다. (15) – 다양한 접근 방법은 EPS (10)를 추출하기 위해 적용됩니다. 그러나, 극도의 복잡성, 하나의 방법에 의해 모든 EPS 성분을 추출하는 것은 거의 불가능하다. 지금까지, 아니 EPS 추출을위한 방법 "하나의 크기는 모두 맞는 없습니다"가. 20 – 추출 방법의 선택은 전체 량뿐만 아니라, 회수 폴리머 13, 16의 조성물뿐만 아니라 영향을 미친다. 슬러지의 형태이자 다양한 방법의 EPS에 의존하는 것이 요구된다.

겔 형성 폴리머를 추출 속성을 특성화하고 서로 비 겔 형성 EPS와의 상호 작용을 조사하는 것은 호기성 입상 슬러지 형성 EPS의 역할을 공개하는 데 도움이 될 것입니다. 또한, 겔 형성 중합체는 산업 분야에서 유용한 생체 고분자도이다. 한가지 가능한 애플리케이션은 이미 용지 (21)의 내수성을 증가시키기 위해 도료로 AGS에서 겔 형성 폴리머를 사용하여 도시 하였다.

따라서, 겔 형성 EPS 특정 추출 방법이 필요하다. 본 연구의 목적은 AGS에서 겔 형성 EPS를 추출하는 방법을 개발하는 것이다. 여섯 추출 방법 1 – 10자주 문학에 사용되는 5,22은, AGS에서 EPS를 추출하기 위해 선정되었다. 총량 추출 EPS의 겔 형성 특성은 각 방법에 대해 비교 하였다.

Protocol

주 : AGS는 폐수 처리장 레흐트 네덜란드에서 Nereda 파일럿 반응기로부터 수집 하였다. 반응기시 하수 공급했다. 과립 슬러지 ㎖ / g VSS 59.5의 오니 량 지수 (SVI를 5 분)를 하였다. 슬러지는 호기성 사이클의 끝 월에 채취 하였다. 샘플링 후, 슬러지는 즉시 실험실로 이송 체질하고 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 하였다. 1. EPS 추출 참고 : 4000 ×의 g, 20 분간 4 ℃에서 원심 분리기 세분화 된 슬러지 및 뜨는을 가만히 따르다. 추출을위한 펠렛의 과립을 수집합니다. 과립의 총 고형물 (TS) 및 휘발성 고형물 (VS)은 표준 방법 (23)에 의해 결정 하였다. 습식 과립 중량의 변환율 – 펠렛으로부터 직접 취해진 과립의 중량 – 및 TS를 추출하기 전에 측정 하였다. 모든 추출은 삼중으로 수행 하였다. 참고 : 3 g 젖은 granules 각각의 추출 방법을 사용 하였다. 삼중 측정 그들의 TS 및 VS 값 (0.39 g의 TS 0.34 g VS)는, 추출 수율을 계산 하였다. 원심 분리 추출 (11) 원심 분리 튜브에 과립의 전송 3g (습 중량) 및 순수 물 50ml로 원심 분리 튜브를 입력합니다. 약간 손으로 원심 분리 튜브를 흔들. 원심 분리기 4,000 × g에서 혼합물을 20 분 동안 4 ° C를 포함하는 원심 분리 관. 유리 비커에 뜨는을 수집 펠렛을 무시하고 1.7 절에 설명 된대로 상층 액을 계속합니다. 초음파 추출 (10) 원심 분리 튜브에 과립의 전송 3g (습 중량) 및 순수 물 50ml로 원심 분리 튜브를 입력합니다. 혼합물에 W 40 2.5 분 동안 얼음에 펄스 초음파를 적용합니다. 원심 분리를 원심 분리기4,000 × g에서 혼합물을 20 분 동안 4 ° C를 포함하는 튜브. 유리 비커에 뜨는을 수집 펠렛을 무시하고 1.7 절에 설명 된대로 상층 액을 계속합니다. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추출 (11) 100 ml의 유리 병에 과립의 전송 3g (습 중량) 2 % (w / v)의 EDTA 용액 50ml로 한 병을 채운다. 약간 손으로 병을 흔들 3 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 보관하십시오. 50 ML의 원심 분리 관에 혼합물을 전송합니다. 원심 분리기 4,000 × g에서 혼합물을 20 분 동안 4 ° C를 포함하는 원심 분리 관. 유리 비커에 뜨는을 수집 펠렛을 무시하고 1.7 절에 설명 된대로 상층 액을 계속합니다. 포름 아미드 – 수산화 나트륨 추출 (수산화 나트륨) 13 100에 과립의 전송 3g (습 중량)㎖의 유리 병은 순수와 50ml로 한 병을 채우고. 0.3 ml의 99 % 포름 아미드를 추가합니다. 약간 손으로 병을 흔들어 1 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 보관하십시오. 과립 현탁액에 20 ml의 1 M NaOH를 추가합니다. 약간 손으로 병을 흔들 3 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 보관하십시오. 이 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 균등하게 혼합물을 전송합니다. 원심 분리기 4,000 × g에서 혼합물을 20 분 동안 4 ° C를 포함하는 원심 분리 튜브. 유리 비커에 뜨는을 수집 펠렛을 무시하고 1.7 절에 설명 된대로 상층 액을 계속합니다. 포름 알데히드 – NaOH를 추출 (11) 100 ml의 유리 병에 과립의 전송 3g (습 중량) 및 순수 물 50ml로 한 병을 채운다. 0.3 ml의 37 % 포름 알데히드를 추가합니다. 약간 손 저장하여 병을 흔들어1 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 그것. 과립 현탁액에 20 ml의 1 M NaOH를 추가합니다. 약간 손으로 병을 흔들 3 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 보관하십시오. 이 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 균등하게 혼합물을 전송합니다. 원심 분리기 4,000 × g에서 혼합물을 20 분 동안 4 ° C를 포함하는 원심 분리 튜브. 유리 비커에 뜨는을 수집 펠렛을 무시하고 1.7 절에 설명 된대로 상층 액을 계속합니다. 고온 – 나트륨 탄산 추출 (나 2 CO 3) 9,22,24 예열 (150)는 80 ° C에 자석 교반기에 1,000 ml의 유리 비커에 물을 누릅니다 ㎖로. 플라스크에 당황하고 순수 물 50ml로 플라스크를 채워 250 ml의에서 과립의 전송 3g (습 중량). 0.25 g 나 2 CO 3, 무수 또는 0.67 g 나 2 CO 3 • 10H 추가 <s플라스크 내에 UB> 2 O는 0.5 %를 얻었다 (W / V) (2) 3 CO 농도 나. 수조 내로 혼합물을 함유하는 플라스크에 넣는다. 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 개별적 플라스크 비커 유리 커버. 400 rpm에서 35 분, 80 ° C의 혼합물을 저어. 50 ML의 원심 분리 관에 혼합물을 전송합니다. 원심 분리기 4,000 × g에서 혼합물을 20 분 동안 4 ° C를 포함하는 원심 분리 관. 상층 액을 수집하고 펠렛을 폐기합니다. 표준 방법 (23)에 따라 모든 추출물의 TS 및 VS 측정. ((차단) MWCO 3,500 다 분자량 투석 가방) 11, 12을 뜨는을 타고 1,000 ml의 초순수에 대한 24 시간 동안 그것을 투석. 투석의 효과를 향상시키기 위해 12 시간 후, 투석 물을 변경한다. 투석 상층 액의 (1/3 정도)에 합리적인 부분을 이동TS 및 측정 (23) VS 알루미늄 접시. 참고 : 하룻밤 105 ° C에서 샘플을 건조시킵니다. 빈 알루미늄 접시 건조 된 샘플을 함유하는 알루미늄 접시의 무게 차이는 TS 함량이다. 그런 다음 2 시간 동안 550 ° C에서 샘플을 포함하는 동일한 알루미늄 접시를 구울 수 있습니다. 빈 알루미늄 접시 및 소성 샘플을 함유하는 알루미늄 접시의 무게 차이는 회분이다. TS 및 재 함량의 차이는 VS 내용입니다. 각 추출물, 10 ㎖ 유리 비이커로 투석 상등액의 잔류 분획 옮긴다. 상등액 중의 중합체의 농도를 증가 1-2 ml의 최종 부피로 60 ℃에서 2 일간 상등액 두꺼워. 2. 알긴산과 같은 세포 외 고분자 (ALE) 추출 단계 1.7.1에 따라 단계 1.6.8에서 얻은 추출물을 투석. 250 ml의 유리 비커에 투석 추출물을 전송합니다. 느린LY 100 rpm으로 실온에서 추출을 교반한다. 산성 형태 ALE를 얻기 위해 2.2 ± 0.05의 최종 pH를 1 M 염산 (HCL)을 첨가하는 동안 끊임없이는 pH 전극 pH 변화를 모니터링한다. 2.2로 pH를 조정 한 후, 4000 × g에서 50 mL의 원심 분리 튜브에서 원심 분리로 추출 전송하고 20 분 동안 39 ° C. 뜨는을 취소하고 젤 같은 펠렛을 수집합니다. 겔상 펠릿 산성 형태 ALE이다. pH가 8.5에 도달 할 때까지 손으로 유리 막대기로 천천히 겔을 혼합하면서 서서히 단계 2.4에서 얻어진 겔에 0.5 M 수산화 나트륨 (0.5 M 수산화 칼륨)을 첨가, 나트륨 (칼륨) ALE의 폼을 얻었다. 3. 이온 하이드로 겔 형성 테스트 참고 : 추출 된 EPS는 이온 성 하이드로 겔 형성 특성, (25)을 사용 하였다 칼슘 이온과 비드 형성 테스트가 있다면 위해 확인합니다. 단계 1.7.3에서 추출물의 농축에 후1-2 ML의 볼륨이 천천히 유리 막대기로 혼합물을 교반 0.5 M NaOH로 8.5로하여 pH를 조정합니다. 단계 3.1 단계 2.5의 나트륨 ALE의 추출물을 가지고 천천히 (염화칼슘 2) 솔루션은 염화칼슘 (/ V W) 2.5 %로 파스퇴르 피펫으로 추출물을 똑. 참고 : 추출 된 EPS 속성을 형성하는 이온 성 하이드로 겔이있는 경우, 드롭 모양 (구형) 비드가 형성 될 것이다. 추출 된 EPS 속성을 형성하는 이온 성 하이드로 겔이없는 경우, 추출물은 CaCl2를 용액에 분산된다. 이오니아 하이드로 겔 4. 안정성 테스트 주 : 상기 AGS 구조 형성 이온 EPS 하이드로 겔의 역할을 이해하기가 안정성 테스트는 단계 3.2에서 수집 나 2 CO 3 추출 이온 겔 비드에서 수행 하였다. 염화칼슘 2 용액에 30 분 동안 하이드로 겔 비드를 유지합니다. 염화칼슘 2에서 하이드로 겔 구슬을 꺼내 숟가락을 사용하여 </suB> 솔루션과 네 개의 동일한 분수에 구슬을 분할합니다. 10 ml의에 보관 분수 (1)는 4 ℃에서 4 시간 동안 물을 탈회. 1.5 – 추출 방법 1.3에 기술 된 바와 같이 다음의 안정성 시험과 동일한 방법으로 수행 하였다. 10 ml의 2 %에 보관 비율이 4 ° C에서 3 시간 동안 (w / v)의 EDTA 솔루션입니다. 7.15 ml의에 보관 분획 3은 4 ℃에서 1 시간 동안 60 μl를 99 % 포름 아미드 물을 탈회. 그 후 4 ° C에서 3 시간 동안 2.85 ml의 1 M NaOH를 저장 분획 3을 추가합니다. 7.15 ml의에 보관 분율 (4)는 4 ℃에서 1 시간 동안 60 μl를 37 % 포름 알데히드 물을 탈회. 그 후 4 ° C에서 3 시간 동안 2.85 ml의 1 M NaOH를 저장 분율 (4)를 추가합니다. 구슬은 추출 조건을 견딜 수 있다면 평가할 4.6-4.3에 기재된 조건 하에서 보관시 비드의 표시 붕괴가 있는지 감시한다.

Representative Results

EPS 추출 다른 EPS 추출 절차를 적용한 후 과립의 외관은도 1에 도시된다. 입자의 형상 및 겔 구조를 원심 분리 (도 1a) 및 EDTA 추출 (도 1C) 후에 그대로였다. 과립은 초음파에 의해 서로 다른 크기의 조각으로 졌 있었다. 탁도가 높은 원심 분리 후 감소로 액상 탁도 인해 작은 단편 (도 1b)의 현탁액 일 수있다. 포름 아미드, 포름 알데히드는 단독으로 과립 형상 및 겔 구조 변화에 영향을주지 않았다 (데이터는 보이지 않음). NaOH를 첨가 한 후, 액상 황색졌다. 일부 솜 물질이 과립의 표면으로부터 분리되고 정착 과립 (도 1D 및 1E)의 상부에 층을 형성 하였다. 아직도, 모양과립은 변경되지 않았습니다. NaOH를 첨가 명백하게 EPS 가용화 개선하지만 겔 매트릭스 구조가 손상 될 수 없었다. 비교하여, 과립을 완전히 나 2 CO 3 추출 (도 1F) 후 사라졌다. 대신 졸상 액체 작은 젤리 형상 입자의 혼합물이 실제로 용해 된 과립의 겔 매트릭스를 도시 형성 하였다. 도 1 호기성 입상 슬러지 EPS 적출이. 과립 각 추출 방법의 효과를 더 잘 시각화, 실험을 25 ㎖ 유리 병에 실시 하였다. 추출 과정 후, 추출물을 부유물 정착 할 수 있도록 실온에서 1 시간 동안 유지 하였다. (A) 원심 분리 추출, (b) 초음파 추출, (c) 추출 EDTA (d) 포름 아미드 – 여분의 NaOHction (전자) 포름 알데히드 – NaOH를 추출, (f)는 고온 -. 나 2 CO 3 추출 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 각 방법에 대한 VS 분율에 대한 EPS 수익률은 그림 2에 도시되어있다. 수율은 과립 VS g의 초기 당 EPS VS mg을 표시됩니다. 포름 알데히드 + NaOH를하여 얻은 EPS의 양의 NaOH + 포름 아미드와 나트륨이 혼합 + 2 CO 3 + 열 원심 분리, 초음파 및 EDTA 추출보다 높았다. 알칼리 조건 EPS 용해도 26,27 향상 나타내는 13,15 – 이러한 추출 기술에 대한 유사한 결과는 이전의 연구 (11)에 의해 나타내었다. 나 2 CO 3로 회수 EPS의 양 단, 원심 분리에 의해 얻어진 것보다 20 배, 가장 높았다. 또한, 나 2 CO 3 추출 EPS 총 수율은 상기 복수의 추출에 의해 향상 될 수있다. 제 1 추출 단계 1.6.8 (프로토콜 섹션)에서 폐기 펠렛을 사용하여 두 번째 추출은 배 추출도 46 %로 전체 생산량 증가, 28 %로 총 수율 증가했다. 그림 VS 수율과 회분에 대한 모든 추출 방법 2. 결과. 각각에 대해 첫 번째 줄은 과립 VS g의 초기 당 EPS VS 밀리그램에서 VS 수율을 나타낸다 추출. 두 번째 줄은 추출 된 TS에서 화산재의 중량 비율을 나타냅니다. 오차 막대는 각각의 추출 기법 수행 세 추출의 표준 편차를 나타낸다."_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 알긴산과 같은 세포 외 중합체 (ALE) 추출 오세영 2 CO 3 추출에 의해 추출 된 EPS의 pH를 2.2로 조정 한 후, 총 VS의 63 %는 침전시켰다. 침전물 산성 ALE 25이다. 잔류 분획 추출 조건하에 가용화 될 수있는 가능성이 EPS했지만, pH를 2.2에서 침전물을 형성 할 수있다. 이온 성 하이드로 겔 형성 시험 호기성 과립 하이드로 겔과 유사한 것으로 설명되었다. 조립 공정은 겔 화제 4,9,25,28 배당체와 같은 겔 형성 현상으로 간주되어왔다. 일반적으로 칼슘은 폐수에서 가장 흔한 양이온 중 하나입니다. 또한, 쉽게 산성 다당류와 결합 (예를 들면,아마도 카운터 이온으로 알기 네이트 및 폴리 갈 락투 산), 겔 29을 중재합니다. , 따라서 이온 가교 하이드로 겔의 결과. 이것은 칼슘 이온의 첨가는 슬러지 호기성 과립 (30)를 가속 할 수 있음을 관찰 하였다. 따라서, 칼슘 -EPS (이온 겔)은 호기성 입상 슬러지 겔 매트릭스 구조를 구축하는 데 중요한 역할을 할 수있다. 이러한 관점에서, 상기 추출 된 EPS 여부 추출 EPS 호기성 입상 슬러지 9 겔 매트릭스의 형성에 기여하는 구조 중합체가 있는지 확인하기위한 테스트로서 이용 될 수 칼슘 이온과 이온 성 하이드로 겔을 형성한다. 본 연구에서는, 다양한 방법으로 AGS (도 3a)로부터 추출 된 EPS 들어 나 2 CO 3 추출 만 EPS 안정한 이온 겔 비드 (w / v)의 CaCl2를 용액 2.5 %의 액체 방울의 형상을 유지하고 형성 .또한, 이것으로부터 얻어진 나트륨 ALE 추가 단계 (ALE 중합체 추출,도 3b)과 같은 속성을 표시하여 EPS. 칼슘 2 + -ALE 겔 비드 (도 3c)의 색상 및 형태는 호기성 입상 슬러지 (그림 3a)과 유사하다. 명백하게, 나 2 CO 3 방법에 의해 추출 된 EPS 호기성 입상 슬러지 겔 매트릭스의 형성에 기여한다. 이 EPS의 주성분 ALE는 이온 성 하이드로 겔을 형성 할 수있는 폴리머 구조이다. 이온 성 하이드로 겔의 안정성 시험 그것은 EPS 추출하는 동안, 호기성 과립 EDTA, 포름 알데히드 + 수산화 나트륨 및 포름 아미드 + 수산화 나트륨 (그림 1)에서 자신의 구형을 유지하는 것이 관찰되었다. CA, 추출 구조 중합체 과립의 안정성에 중요한 역할을하면 이해하기 위해서는 2+ -ALE 구슬이었다추출 동안 호기성 입자와 동일한 방식으로 정확하게 처리 하였다. 즉, 칼슘 -ALE 비즈 EDTA 매우 안정 – 흥미롭게도, 칼슘 -ALE 구슬은 AGS의 것과 유사한 안정성 (3 층도 3d)를 표시. 칼슘의 표면에서 분리 ALE의 작은 양이 있었다 2+ -ALE 구슬 3 시간 (작은 갈색 그림 3E에서 플록과 3 층), 칼슘 2 + -ALE 구슬이 포름 알데히드에 배어 있었다 + 수산화 나트륨 및 포름 아미드 + NaOH를 각각. 칼슘 -ALE 구슬과 호기성 과립 사이의 안정성의 관점에서이 유사성은 ALE는 AGS 겔 매트릭스를 형성하는 중요한 구조 폴리머의 한 부분 있음을 나타냅니다. 그림 3. 에어로빅 과립과 추출 ALE은. (a)는 순수 홍보에 과립IOR 추출. 4,000 × g에서 원심 분리하고 20 분 동안 4 ° C 후 (단락 1.6 및 2에 따라 추출) (b)는 산성 ALE. 이온 겔의 안정성 시험 결과. (다) 칼슘 2 + -ALE 구슬은 4 ℃에서 4 시간 동안 탈염수에 저장된다. (d) 칼슘 -ALE 비드는 4 ℃에서 3 시간 동안 2 % EDTA에 저장된다. (e)에 4 ℃에서 4 시간 동안 포름 아미드 + 수산화 나트륨에 저장된 칼슘 -ALE 구슬. (바) 카 4 ° C에서 4 시간 동안 포름 알데히드 + NaOH를 저장 2+ -ALE 구슬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

프로토콜 섹션에 대한 설명
EPS / ALE의 추출 50 ml의 부피 및 과립 3g에 대해 설명한다. 이 값은 가이드 라인으로 구성된다. 높은 과립 농도와 추출은 추출 된 EPS의 수율을 감소시킬 수있다. ALE의 추출 동안 온도를 30 분 동안 80 ℃에서 일정하게 유지되어야한다. 데워 혼합물에 필요한 시간 (약 5 분)이 프로토콜에 포함된다. 또한, 추출 효율을 플라스크 바닥의 직경과 동일한 크기의 마그네틱 교반 막대를 사용하여 강화된다. 이 EPS의 추출을 촉진, 좋은 믹싱 특성과 밀링 효과가 발생합니다.

나중에 프로토콜 섹션에서 (단계 1.1-1.6에서 수집 한 상층 액) 모든 추출의 TS 및 VS 수익률이 결정된다. 투석 추출에 사용되는 화학 물질의 존재로 인해 잠재적 인 오류를 감소시키기 전에 TS 및 VS 측정을 수행 할 필요가있다. 에이3500 다의 MWCO는 투석 부대 내에서 EPS의 거대 분자를 유지하면서 이러한 화학 물질을 제거하는 것이 좋습니다. 투석 가방 추출물의 양보다 더 큰 볼륨이 있어야합니다. 추출물의 부피는 (최대 40 % 양 증가 EDTA 추출을 위해, 예) 투석 동안 증가하기 때문에 필요하다. 투석에 의한 화학 물질 제거의 정도는 종래 투석 후 시료의 pH를 측정하여 결정될 수있다. 대안 적으로, 투석 물의 전도도를 측정 이온 제거의 정도를 나타낸다.

총 추출 된 EPS에서 ALE를 획득 (1.6 단계, 2) 투석 단계는 선택 사항입니다합니다. 그럼에도 불구하고, 투석 세 가지 장점을 갖는다 : 그것은 침전 필요한 염산의 양이,이 추출물의 산성 물질 전달을 향상시키고, 얻어진 ALE의 회분 함량을 감소 줄인다. ALE의 침전을 위해 extrac보다 훨씬 더 큰 볼륨과 유리 비커를 사용하는 것이 좋습니다티. 나 2 CO 3은 일반적으로 과용 추출된다. 샘플에 발포 이전 투석되지 않은 경우 먼저 나 2 CO 3와 반응 첨가 HCl을 이산화탄소의 형성의 결과로, 좌측 및 추출물. HCl을 첨가하는 동안, 추출액을 비이커의 바닥과 같은 크기의 마그네틱 교반 막대를 천천히 교반한다. 이 크기 천천히 교반의 교반 막대 심지어 침전물의 구조를 파괴하지 않고 혼합 발생합니다. 산성 겔 덩어리가 추출 형성하는 경우 비이커 손으로 약간 소용돌이한다. 침전은 여전히 ​​샘플에서의 산의 균질 한 분포를 가지면서도 추출물의 대량 증가를 피하기 위해 1 M의 산 농도를 행한다. 높은 산 농도는 지역의 pH 감소 및 산성 젤 덩어리 형성 될 수 있습니다. 2.0보다 낮은 pH는 아마도 구조적 변화를 복구 할 수 ALE의 양을 감소낮은 pH에서의 중합체. 2.20 ± 0.05에서 최종 pH를 유지하는 것이 중요하다.

제한
에일 맥주 추출 방법은 일반적으로 AGS 또는 생물막에서 EPS의 구조 세포 외 고분자를 추출하는 것을 목표로하고 모든 존재 EPS를 추출하기위한 것이 아닙니다. 모든 EPS를 추출하는 하나 이상의 추출 방법의 조합이 필요하다. 배와 배 추출을 적용하여 VS EPS 생산량의 증가와 같이 또한, 하나의 추출은 모든 구조 EPS를 추출하지 않습니다. ALE 추출 열 및 알칼리성 조건으로 일정한 혼합 결합 가혹한 EPS 추출법이다. 이러한 이유로 일부 세포 내 물질이 EPS와 함께 추출되는 것이 가능하다. 세포 용해는 물리적, 화학적 추출 기술 (초음파 31, 32, 31, 32 수산화 나트륨, EDTA 11,32, CER (32), 열 (32)과 높은 전단 속도 m에 의해 발생 될 수 있지만) 19 ixing 회수 EPS 세포 내 물질의 존재는 여전히 검증 할 필요가있다. 복구 된 EPS는 세포 내 물질이 분석되지 않은 포함되어 있는지 여부를 추출 EPS의 이온 겔 형성 특성은 본 연구의 주요 초점이다. 앞으로의 연구는 추출 된 EPS에서 세포 물질들을 식별에 초점을 맞출 것이다.

AGS의 하이드로 겔 매트릭스를 용해하는 구조 EPS를 추출하는 데 매우 중요하다
EPS 폼 AGS의 조밀 한 소형 하이드로 겔 매트릭스. EPS는 모두하지 다당류, 단백질, 핵산, (포스) 지질, 휴믹 물질 및 일부 세포 간 고분자 7,5,8, 등의 유기 고분자의 다양한 클래스가 포함되어 있지만 겔을 형성한다. 만 겔 형성 폴리머가 여기에 EPS의 구조 폴리머로 간주됩니다.

EPS의 추출의 목표는 제 EPS를 가용화하고 가용화 EPS를 수집하는 것이다. 구조 EPS (즉, t 경우그는) 하이드로 겔을 형성하는 EPS 추출의 대상이며, AGS의 겔 매트릭스 먼저 가용화한다. 겔 매트릭스를 용해시킬 수있는 유일한 방법은 EPS 구조를 추출 할 수있다. 15, 초음파 10,14,15, EDTA – 10 – 12,14,15, 포름 알데히드 + NaOH를 10 – 수산화 나트륨 (13)가 효율적으로 구조를 분리 할 수 없습니다 + (15)과 포름 아미드 본 연구에서는 몇 가지 자주 원심 분리 10 EPS 추출 방법을 사용 EPS. 이 호기성 과립의 하이드로 겔 매트릭스는 다음의 방법에 의해 용해되지 때문이다. 이러한 이유로, 섹션 4의 안정성 시험은 EDTA, 포름 아미드 + 수산화 나트륨의 현상과 포름 알데히드 + NaOH를 추출하여 수행 하였다. 이 세 가지 추출 구조적 EPS를 분리 할 수 없었다, 여전히 나 2 CO 3 추출 외에 최고 VS EPS 수율을 얻을. 약관 오F 오세영 2 CO 3 추출 명확 AGS 행렬을 가용화이 추출 방법으로 적용되지 않았다. 따라서 안정성 시험시 적용 조건이 대표로 간주되었다.

CER와 EPS 추출에 대한 이전의 연구는 현재 사용되는 화학 추출보다 더 나은 결과를 산출하지 않았다로서 양이온 교환 수지 (CER) 또 다른 자주 사용되는 EPS 추출 방법으로 추출하고,이 비교를 고려하지 않았다.

AGS에 EPS를 젤 형성
젤 형성 EPS는 AGS의 하이드로 겔 매트릭스 구조 EPS로 간주됩니다. 이는 이온 성 겔, 온도 – 유발 겔 pH를 유발 겔 등의 하이드로 겔의 여러 가지가 있다고 지적 가치가있다. 이 연구는 이온 젤을 형성 EPS에 초점을 맞추고 있습니다. 추출 구조 겔 물질의 많은 부분에 관해서는,이 지배적 구조 EPS가 될 가능성이있다. 가능성은 확실히있다 그 EPS 다른 종류의열린 하이드로 겔의 다른 종류 (예를 들면, pH를 유발 겔 28) 호기성 과립은 동일하거나 다른 형태에 존재한다. 그럼에도 불구하고, 아무리 하이드로 겔의 종류는 EPS 겔 매트릭스 겔 형성 EPS를 추출하는 가장 중요한 단계입니다 가용화, 대상이되지 않습니다.

현재 연구는 거의 입상 슬러지의 구조 EPS에 완료되었습니다. 이 프로토콜에서 설명 ALE 추출 AGS에서 겔 형성 EPS를 추출 할 수있는 구조적 특징을 EPS 향후 연구에 사용한다. 더 많은 연구가 더 과립과 EPS의 과정과 기능을 이해하는 AGS, 구조 EPS 및 비 구조적 EPS에 수행해야합니다. 미생물 EPS의 정확한 조성물 및 방법 EPS들의 조성은 환경 변화에 따라 변경된다 무엇 EPS 같은 대량 생산 이유 : 특히 다음의 세 가지 점을 검토 할 필요가있다. 검출 관련된 모든 화합물 및 이의 interacti 분석기능은 생물막 어떻게 우리의 장점을 사용하는 방법을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.

Materials

250 ml baffled flask Kimble 25630-250
1000 ml glass beaker VWR 213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer IKA 3810000
sodium carbonate decahydrate Merck KGaA 1063911000
50 ml centrifugation tubes greiner bio-one 227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge Heraeus/Thermo Scientific –
hydrochloric acid, 37 % Sigma-Aldrich 30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker VWR 213-1124
calcium chloride dihydrate Merck KGaA 1023821000
1 ml Pasteur Pipette Copan 201C
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Referências

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Structural Extracellular Polymeric SubstancesAerobic Granular SludgeEPS ExtractionCentrifugationSodium CarbonateDialysisAcidic FormGel-like Pellet

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Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C., Lin, Y. M. Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge. J. Vis. Exp. (115), e54534, doi:10.3791/54534 (2016).
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