Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Bioaktive små molekyler fundamentalt arbejde ved at interagere med og ændre funktionen af ​​en eller flere "target" molekyler, mest almindeligt proteiner, i cellen. I lægemiddelforskning, når en aktiv forbindelse er opdaget gennem fænotypisk screening, identifikation af det molekylære mål (r) af denne forbindelse er afgørende, ikke kun for at forstå virkningsmekanisme og potentielle bivirkninger af forbindelsen, men også for potentielt at opdage ny biologi ligger til grund for sygdommen model og bane vejen for udvikling af nye mekanistiske klasser af lægemidler ^1. Selvom identifikation mål ikke er nødvendig for et lægemiddel, der skal anvendes terapeutisk, i de senere år har der været en stigende erkendelse af, at nye lægemiddelkandidater er mere tilbøjelige til at lykkes i kliniske forsøg, og derfor giver bedre afkast på investeringer, hvis en valideret target er kendt ^2. Der har således været en stigende interesse for fremgangsmåder til identifikation af småmolekyle målproteiner.

En klassisk target identifikation Eksperimentet afhænger typisk af affinitetsoprensning, hvor den lille molekyle af interesse immobiliseres på en harpiks og inkuberet med helcellelysater, hvorefter ubundne proteiner vaskes bort, og de ​​resterende proteiner elueres og identificeres ^3. Mens denne teknik er blevet anvendt til at identificere målene for mange små molekyler ^4, den er uegnet som en universel target ID metode af flere grunde. For det første skal målproteinet bevare sin native konformation ved cellelyse, for at bevare sin evne til at binde til den lille molekyle. Dette kan være særligt problematisk for membranproteiner, som ofte undergår konformationelle ændringer efter at være blevet fjernet fra deres native miljø, eller blot aggregat og udfældes fra opløsningen. For det andet skal den lille molekyle modificeres kemisk på en sådan måde, at det kan immobiliseres på harpiksen under opretholdelsedets evne til at binde målproteinet. Dybe bindingslommer kan derfor blive utilgængelige for et lille molekyle, når den er fastgjort til harpiksen. For det tredje skal bindingsaffiniteten være tilstrækkelig høj, at interaktionen opretholdes under vasketrinene, hvilket gør identifikation af lavere affinitet interaktioner udfordrende. Fjerde, miljøforhold såsom pH, ion koncentration, eller tilstedeværelsen af ​​andre endogene molekyler kan variere rumligt inden i cellen, og til tider er forudsætninger for lægemiddel-target interaktioner. Således, at finde de korrekte betingelser til at tillade og vedligeholde bindende ydersiden af ​​cellen kan kræve en betydelig mængde af trial and error.

Fotoaffinitetsmærkning omgår disse problemer ved at tillade kovalent binding af et lille molekyle og dets mål inden den native forbindelse med en celle. Snarere end at immobilisere det lille molekyle til en stor voluminøs harpiks, er molekylet i stedet kemisk modificeret til at installere to små funktionelle groups: en fotoaktiverbart del, der tillader kovalent tværbinding til målproteinet ved bestråling med en bestemt bølgelængde af lys, og en reportergruppe, der tillader at målproteinet blive opdaget og efterfølgende isoleret. Levende celler behandles med fotoaffinitets probe, proben binder og kovalent tværbinder til målproteinet, og proben-proteinkomplekset isoleres derefter intakt. Specificiteten af ​​proben binding til målet påvises ved at udføre en konkurrence eksperiment parallelt, hvor et overskud af stamforbindelsen anvendes til at konkurrere væk binding af proben til målproteinet.

Den design og syntese af fotoaffinitet sonder varierer meget fra den ene lille molekyle til et andet, og vil ikke blive dækket i denne protokol; har dog flere gode diskussioner om emnet blevet offentliggjort ^5-9. Den væsentligste overvejelse er, at sonden bevarer bioaktivitet af stamforbindelsen, derfor presumably binding til det samme target (s). Struktur-aktivitetsforhold (SAR) -undersøgelser skal udføres for at bestemme, hvilke dele af molekylet kan modificeres uden tab af bioaktivitet. En række forskellige kemiske grupper er blevet anvendt som fotoaktiverbare tværbindere, herunder diazirine, benzophenon, og aryl azid, som hver har fordele og ulemper ^10. Ligeledes er der flere reporter tags, der er blevet anvendt til at isolere probe-bindende proteiner. Reportergrupper kan være funktionel på egen hånd, såsom den almindeligt anvendte biotin eller fluorescerende mærker, eller kan være forstadier, der kræver yderligere funktionalisering efter fototværbindingen trin, som har den fordel at være mindre og dermed mindre tilbøjelige til at gå på kompromis bioaktivitet ^11.

I denne protokol, har vi brugt en fotoaffinitet sonde, der indeholder en diazirine fototværbinding gruppe, og en terminal alkyn til fastgørelse af en reporter gruppen gennem en Cu (I) -catalyzed azid-Alkyn Sharpless-Huisgen cycloaddition (eller klik) reaktion ^12-15. SAR studier, probe design og syntese, og resultaterne af disse undersøgelser er blevet offentliggjort andre steder ^16-18.