We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Bioaktive små molekyler fundamentalt arbejde ved at interagere med og ændre funktionen af en eller flere "target" molekyler, mest almindeligt proteiner, i cellen. I lægemiddelforskning, når en aktiv forbindelse er opdaget gennem fænotypisk screening, identifikation af det molekylære mål (r) af denne forbindelse er afgørende, ikke kun for at forstå virkningsmekanisme og potentielle bivirkninger af forbindelsen, men også for potentielt at opdage ny biologi ligger til grund for sygdommen model og bane vejen for udvikling af nye mekanistiske klasser af lægemidler 1. Selvom identifikation mål ikke er nødvendig for et lægemiddel, der skal anvendes terapeutisk, i de senere år har der været en stigende erkendelse af, at nye lægemiddelkandidater er mere tilbøjelige til at lykkes i kliniske forsøg, og derfor giver bedre afkast på investeringer, hvis en valideret target er kendt 2. Der har således været en stigende interesse for fremgangsmåder til identifikation af småmolekyle målproteiner.
En klassisk target identifikation Eksperimentet afhænger typisk af affinitetsoprensning, hvor den lille molekyle af interesse immobiliseres på en harpiks og inkuberet med helcellelysater, hvorefter ubundne proteiner vaskes bort, og de resterende proteiner elueres og identificeres 3. Mens denne teknik er blevet anvendt til at identificere målene for mange små molekyler 4, den er uegnet som en universel target ID metode af flere grunde. For det første skal målproteinet bevare sin native konformation ved cellelyse, for at bevare sin evne til at binde til den lille molekyle. Dette kan være særligt problematisk for membranproteiner, som ofte undergår konformationelle ændringer efter at være blevet fjernet fra deres native miljø, eller blot aggregat og udfældes fra opløsningen. For det andet skal den lille molekyle modificeres kemisk på en sådan måde, at det kan immobiliseres på harpiksen under opretholdelsedets evne til at binde målproteinet. Dybe bindingslommer kan derfor blive utilgængelige for et lille molekyle, når den er fastgjort til harpiksen. For det tredje skal bindingsaffiniteten være tilstrækkelig høj, at interaktionen opretholdes under vasketrinene, hvilket gør identifikation af lavere affinitet interaktioner udfordrende. Fjerde, miljøforhold såsom pH, ion koncentration, eller tilstedeværelsen af andre endogene molekyler kan variere rumligt inden i cellen, og til tider er forudsætninger for lægemiddel-target interaktioner. Således, at finde de korrekte betingelser til at tillade og vedligeholde bindende ydersiden af cellen kan kræve en betydelig mængde af trial and error.
Fotoaffinitetsmærkning omgår disse problemer ved at tillade kovalent binding af et lille molekyle og dets mål inden den native forbindelse med en celle. Snarere end at immobilisere det lille molekyle til en stor voluminøs harpiks, er molekylet i stedet kemisk modificeret til at installere to små funktionelle groups: en fotoaktiverbart del, der tillader kovalent tværbinding til målproteinet ved bestråling med en bestemt bølgelængde af lys, og en reportergruppe, der tillader at målproteinet blive opdaget og efterfølgende isoleret. Levende celler behandles med fotoaffinitets probe, proben binder og kovalent tværbinder til målproteinet, og proben-proteinkomplekset isoleres derefter intakt. Specificiteten af proben binding til målet påvises ved at udføre en konkurrence eksperiment parallelt, hvor et overskud af stamforbindelsen anvendes til at konkurrere væk binding af proben til målproteinet.
Den design og syntese af fotoaffinitet sonder varierer meget fra den ene lille molekyle til et andet, og vil ikke blive dækket i denne protokol; har dog flere gode diskussioner om emnet blevet offentliggjort 5-9. Den væsentligste overvejelse er, at sonden bevarer bioaktivitet af stamforbindelsen, derfor presumably binding til det samme target (s). Struktur-aktivitetsforhold (SAR) -undersøgelser skal udføres for at bestemme, hvilke dele af molekylet kan modificeres uden tab af bioaktivitet. En række forskellige kemiske grupper er blevet anvendt som fotoaktiverbare tværbindere, herunder diazirine, benzophenon, og aryl azid, som hver har fordele og ulemper 10. Ligeledes er der flere reporter tags, der er blevet anvendt til at isolere probe-bindende proteiner. Reportergrupper kan være funktionel på egen hånd, såsom den almindeligt anvendte biotin eller fluorescerende mærker, eller kan være forstadier, der kræver yderligere funktionalisering efter fototværbindingen trin, som har den fordel at være mindre og dermed mindre tilbøjelige til at gå på kompromis bioaktivitet 11.
I denne protokol, har vi brugt en fotoaffinitet sonde, der indeholder en diazirine fototværbinding gruppe, og en terminal alkyn til fastgørelse af en reporter gruppen gennem en Cu (I) -catalyzed azid-Alkyn Sharpless-Huisgen cycloaddition (eller klik) reaktion 12-15. SAR studier, probe design og syntese, og resultaterne af disse undersøgelser er blevet offentliggjort andre steder 16-18.
Forskellige tilgange til at identificere målene i små molekyler kan groft inddeles i to kategorier: top-down, hvor den cellulære fænotype af lægemidlet bruges til at indsnævre sine potentielle mål baseret på deres kendte funktioner, eller bottom-up, hvor målet identificeres direkte ved kemisk eller genetisk middel 3. Top-down eller fænotypiske undersøgelser kan identificere visse cellulære processer, der berøres af lægemidlet (fx transkription / translation / DNA-syntese, cellecyklus bl…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |