En fælles naturlige miljø, hvor mikrobielle patogener oplever syre-induceret proteinudfoldning betingelser er den mammale maven (pH område 1-4), hvis sur pH tjener som en effektiv barriere mod fødevarebårne patogener ^1. Proteinudfoldning og aggregering, som er forårsaget af aminosyresidekæde protonering, påvirker biologiske processer, skader cellulære strukturer og i sidste ende forårsager celledød ^1,2. Da pH af den bakterielle periplasma ligevægt næsten øjeblikkeligt med den miljømæssige pH på grund af den frie diffusion af protoner gennem den porøse ydre membran, periplasmatiske og indre membranproteiner fra gramnegative bakterier er de mest sårbare cellulære komponenter under syre-stressbetingelser ^3. For at beskytte deres periplasmatisk proteom mod hurtig syre-medieret skade, Gram-negative bakterier udnytte syre-aktiverede periplasmatiske chaperoner HdeA og HdeB. HdeA er en betinget uorganiseret chaperone <sup> 4,5: ved neutral pH, HdeA er til stede som en foldet, chaperone-inaktiv dimer. Ved en pH-ændring under pH 3, er HdeA s chaperone-funktion hurtigt aktiveret ^6,7. Aktivering af HdeA kræver dybtgående strukturelle ændringer, herunder dets dissociation i monomerer, og den delvise udfoldning af monomerer ^6-8. Når den er aktiveret, HdeA binder til proteiner, der udfolder sig under sure betingelser. Det forhindrer effektivt deres aggregering både under inkubationen ved lav pH samt ved pH neutralisering. Ved tilbagevenden til pH 7,0, HdeA letter refoldning af sine klient proteiner i en ATP-uafhængig måde og konverterer tilbage til sin dimert chaperone-inaktiv form ^9. Tilsvarende er den homologe chaperone HdeB også chaperone-inaktiv ved pH 7,0. I modsætning HdeA dog HdeB s chaperone aktivitet når sit tilsyneladende maksimum ved pH 4,0, under hvilke betingelser HdeB er stadig i vid udstrækning foldede og dimere ^10. Desuden yderligere sænke pH causes inaktivering af HdeB. Disse resultater tyder på, at på trods af deres omfattende homologi, HdeA og HdeB forskellige i deres form for funktionel aktivering giver dem mulighed for at dække et bredt pH-område med deres beskyttende chaperone funktion. En anden chaperone, der er blevet impliceret i syreresistensen af E. coli er det cytoplasmatiske Hsp31, som synes at stabilisere ufoldede klient proteiner indtil neutrale betingelser er genoprettet. Den præcise tilstand af Hsp31 aktion, dog er forblevet gådefulde ^12. I betragtning af, at andre tarmpatogene bakterier såsom salmonella mangler hdeAB operon, er det meget sandsynligt, at andre endnu uidentificerede periplasmatiske chaperoner kan findes, der er involveret i syre modstand af disse bakterier ^11.

Protokollerne præsenteres her tillader at overvåge pH-afhængig chaperonaktivitet af HdeB in vitro og in vivo ¹⁰ og kan anvendes til at undersøge andre chaperonersåsom Hsp31. Alternativt kan det komplekse net af transkriptionsfaktorer, der styrer ekspressionen af hdeAB potentielt undersøges af in vivo-stress assay. At karakterisere chaperone funktionen af proteiner in vivo, kan forskellige forsøgsopstillinger anvendes. En rute er at anvende protein udfoldning stresstilstande og fænotypisk karakterisering mutantstammer, der enten overudtrykker genet af interesse eller bærer en deletion af genet. Proteom undersøgelser kan udføres for at identificere, hvilke proteiner ikke længere aggregat under stressbetingelser når chaperonen er til stede, eller påvirkning af en chaperone på et specifikt enzym kan bestemmes under stressbetingelser anvendelse af enzymatiske assays ^14-16. I denne undersøgelse valgte vi at overudtrykke HdeB i en rpoH deletion-stamme, som mangler varmechok sigma faktoren 32. RpoH styrer ekspressionen af alle større E. coli chaperones og sletning er kendt for at øge sensitivity for miljømæssige stress betingelser, der forårsager protein udfoldning ^15. In vivo chaperonaktivitet af HdeB blev bestemt ved at overvåge dets evne til at undertrykke pH følsomheden af Δ rpoH-stamme. Alt i alt, de protokoller, der præsenteres her giver en hurtig og enkel fremgangsmåde til at karakterisere aktiviteten af et syreaktiveret chaperone in vitro såvel som in vivo sammenhæng.