Summary

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> In Vitro</em> en<em> In Vivo</em

Published: October 23, 2016
doi:

Summary

Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.

Abstract

De bacteriën worden vaak blootgesteld aan veranderingen in de omgeving, zoals veranderingen in pH, temperatuur, redox status belichting of mechanische kracht. Veel van deze aandoeningen veroorzaken eiwitontvouwende in de cel en hebben nadelige invloed op de overleving van het organisme. Een groep van onafhankelijke, stress-specifieke moleculaire chaperones is aangetoond dat essentiële rol spelen bij de overleving van deze stresscondities. Terwijl volledig gevouwen en chaperonne-inactief voor stress, deze eiwitten snel ontvouwen en worden chaperone-actief onder specifieke stress-condities. Eenmaal geactiveerd, deze conditioneel wanordelijke chaperones binden aan een groot aantal verschillende aggregerende eiwitten voorkomen dat hun aggregatie en proteïne hervouwing bij terugkeer naar niet-stressomstandigheden direct of indirect vergemakkelijken. De primaire benadering voor het verkrijgen van een meer gedetailleerd begrip van het mechanisme van de activatie en client erkenning omvat de zuivering en subsequent karakterisering van deze eiwitten toepassing van in vitro assays chaperon. Follow-up in vivo stress-tests zijn absoluut essentieel om zelfstandig te bevestigen de in vitro resultaten.

Dit protocol beschrijft in vitro pt in vivo methoden om de chaperone activiteit van E. karakteriseren coli HdeB een zuur geactiveerde chaperonne. Lichtverstrooiingsmetingen werden gebruikt als geschikte uitlezing capaciteit HdeB om zuur-geïnduceerde aggregatie van een gevestigd model client eiwit, MDH voorkomen in vitro. Analytische ultracentrifugatie-experimenten werden toegepast op complexvorming tussen HdeB en haar opdrachtgever eiwit LDH onthullen, om licht te werpen op het lot van de cliënt eiwitten op hun terugkeer naar non-stress-condities. Enzymatische activiteit assays van de cliënt eiwitten werden uitgevoerd om de effecten van HdeB op pH geïnduceerde client inactivatie en reactivering controleren. Ten slotte werden de overleving studies gebruikt om Monitor de invloed van HdeB's chaperone functie in vivo.

Introduction

Een gemeenschappelijke natuurlijke omgeving waarin microbiële ziekteverwekkers ervaren zuur-geïnduceerde eiwit ontvouwen omstandigheden is het zoogdier maag (pH 1-4), waarvan de zure pH fungeert als een effectieve barrière tegen voedsel overgedragen pathogenen 1. Eiwitontvouwende en aggregatie, die wordt veroorzaakt door aminozuurzijketen protonering, beïnvloedt biologische processen, schade celstructuren en uiteindelijk leidt tot celdood 1,2. Aangezien de pH van het bacteriële periplasma in evenwicht vrijwel onmiddellijk de pH van het milieu door de vrije diffusie van protonen door de poreuze buitenste membraan periplasmische en binnenste membraan eiwitten van Gram-negatieve bacteriën zijn de meest kwetsbare cellulaire componenten onder zure-stressomstandigheden 3. Om hun periplasmische proteoom tegen snelle-zuur bemiddelde schade te beschermen, Gram-negatieve bacteriën maken gebruik van de zuur geactiveerde periplasmatische chaperones HdeA en HdeB. HdeA is een voorwaardelijk ontregeld chaperonne <sup> 4,5: Bij neutrale pH, HdeA aanwezig als een gevouwen, chaperone-actief dimeer. Bij een pH-verschuiving onder pH 3, wordt HdeA's chaperone functie snel geactiveerd 6,7. Activering van HdeA vereist ingrijpende structurele veranderingen, inclusief de dissociatie in monomeren en de gedeeltelijke ontvouwing van de monomeren 6-8. Eenmaal geactiveerd HdeA bindt aan eiwitten die zich ontvouwen onder zure omstandigheden. Het voorkomt effectief hun aggregatie, zowel tijdens de incubatie bij lage pH alsmede op pH neutralisatie. Bij terugkeer naar pH 7,0, HdeA vergemakkelijkt het opnieuw vouwen van zijn cliënt eiwitten in een ATP-onafhankelijke wijze en zet terug in zijn dimeer, chaperonne-inactieve conformatie 9. Ook de homologe chaperon HdeB ook chaperone-inactief bij pH 7,0. In tegenstelling tot HdeA echter HdeB's chaperone activiteit bereikt haar ogenschijnlijke maximum bij pH 4,0, onder welke voorwaarden HdeB is nog grotendeels gevouwen en dimeer 10. Bovendien verdere verlaging van de pH causes de inactivatie van HdeB. Deze resultaten suggereren dat ondanks hun uitgebreide homologie, HdeA en HdeB verschillen in hun wijze van functionele activatie waarbij zij een breed pH-traject met hun beschermende chaperone functie dekken. Een andere chaperone die is betrokken bij de zuurbestendigheid van E. coli is de cytoplasmatische Hsp31, die lijkt te ongevouwen client eiwitten te stabiliseren tot neutrale omstandigheden worden hersteld. De precieze werkingsmechanisme Hsp31's, echter, is raadselachtig 12 gebleven. Aangezien andere enteropathogene bacteriën zoals Salmonella niet de hdeAB operon, is het zeer waarschijnlijk dat andere ongeïdentificeerde periplasmatische chaperons kunnen bestaan die betrokken zijn bij zuurbestendigheid van deze bacteriën 11 zijn.

De protocollen die hier laat de pH-afhankelijke chaperone activiteit van HdeB controleren in vitro pt in vivo 10 en kunnen worden toegepast op andere chaperons onderzoekenzoals Hsp31. Als alternatief, het complex netwerk van transcriptiefactoren die de expressie van hdeAB controle kan mogelijk worden onderzocht door de spanning in vivo assay. Om de chaperone functie van eiwitten in vivo te karakteriseren, kan verschillende experimentele opstellingen worden toegepast. Een route naar eiwitontvouwende stressomstandigheden toepassing en fenotypische karakterisatie van mutante stammen die hetzij overexpressie het gen van belang of een bij deletie van het gen. Proteomics studies kunnen worden uitgevoerd om eiwitten te identificeren die niet langer aggregaat stressomstandigheden als de chaperonne aanwezig is, of de invloed van een chaperonne op een specifiek enzym kan tijdens stressomstandigheden middels enzymatische assays 14-16 bepaald. In deze studie hebben we ervoor gekozen om HdeB overexpressie in een rpoH deletie stam, die de warmte shock sigma factor 32. rpoH de expressie van alle belangrijke E. controleert ontbeert coli chaperones en de deletie bekend sens vergrotenItivity ecologische stress omstandigheden die eiwitontvouwende 15 veroorzaken. De in vivo activiteit van chaperone HdeB werd bepaald door het volgen zijn vermogen om de pH gevoeligheid van de Δ rpoH stam onderdrukken. In totaal protocollen die hier zorgen voor een snelle en eenvoudige benadering om de activiteit van een zuur geactiveerde chaperone karakteriseren in vitro als in in vivo context.

Protocol

1. Expressie en zuivering van Periplasmatische HdeB OPMERKING: HdeB werd tot expressie gebracht in E. coli-cellen die het plasmide pTrc- HdeB 10 en gezuiverd uit het periplasma van polymyxine lysis. Bereid een overnachting cultuur van E. coli-cellen die het plasmide pTrc- HdeB 10 in 30 ml LB met 200 ug / ml ampicilline (LB Amp). Inoculeer vier cultures 1 L LB Amp en ze groeien bij 37 ° C en 200 rpm, tot OD 600 nm</su…

Representative Results

HdeA en HdeB homoloog E. coli eiwitten bekend periplasmatische eiwitten te beschermen tegen zure stressomstandigheden 10. Ons werk blijkt dat vergelijkbaar HdeA, HdeB functioneert ook als een zure moleculaire chaperon geactiveerd. In tegenstelling tot HdeA, HdeB functies op een pH die potentieel nog bactericide, maar aanzienlijk hoger dan het pH optimum van HdeA 6,9,10,22. Om het pH optimum van HdeB's chaperone activiteit in vitro te onderzoeke…

Discussion

Om het mechanisme van activering en chaperone functie van HdeB bestuderen, grote hoeveelheden HdeB moet expressie gebracht en gezuiverd. Verschillende expressie vectorsystemen zijn beschikbaar voor de productie van hoge niveaus van een doelwiteiwit, waaronder pTrc of pBAD vectoren, die beide werden gebruikt in deze studie. De promotors zijn gemakkelijk toegankelijk zijn voor E. coli RNA polymerase en laten dan sterk opgereguleerd expressie van HdeB in een E. coli stam. Dit aspect is bijzonder rel…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Claudia Cremers voor haar nuttig advies over chaperon assays. Ken Wan is erkend voor zijn technische bijstand in HdeB zuivering. Dit werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute (tot JCAB) en de National Institutes of Health subsidie ​​RO1 GM102829 om JCAB en Ujj-UD wordt ondersteund door een postdoctoraal research fellowship van de Duitse Research Foundation (DFG).

Materials

NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 UM pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764 https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

Referências

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  18. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  19. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  20. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  21. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  22. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
  23. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  24. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
check_url/pt/54527?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Dahl, J., Koldewey, P., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

View Video