La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation
Summary
Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales.
Abstract
enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches de la moelle épinière se sont révélés être une technique précieuse pour enquêter sur un large éventail de questions, de cellulaire aux propriétés du réseau. Nous montrons comment préparer des tranches obliques viables de la moelle épinière des souris jeunes (P2 – P11). Dans cette préparation, les motoneurones conservent leurs axones sortant des racines ventrales de la moelle épinière. La stimulation de ces axones suscite back-propageant des potentiels d'action qui envahissent le soma des motoneurones et passionnants nantissements l'motoneuronales au sein de la moelle épinière. Enregistrement des potentiels d'action antidromiques est une façon immédiate, définitive et élégante pour caractériser l'identité du motoneurone, qui surpasse les autres méthodes d'identification. En outre, la stimulation des nantissements de motoneurones est un moyen simple et fiable pour exciter les cibles collatérales des motoneurones au sein de la moelle épinière, comme d'autres motoneurones ou Renshaw cellules. Dans ce protocole, nous présentons les enregistrements antidromiques du motoneurone somas ainsi que Renshaw cellulaire excitation, résultant de la stimulation de la racine ventrale.
Introduction
Historiquement, les enregistrements de motoneurones utilisant sharp-électrode ont été réalisées in vivo sur les grands animaux tels que les chats ou rats 1 ou sur un ensemble de la moelle épinière isolée chez la souris 2. L'émergence de la technique d'enregistrement patch-clamp pendant les années 1980, a appelé à un accès direct à la motoneurone somas que l'étanchéité nécessaire pour être réalisé sous guidage visuel. Ainsi, la moelle épinière préparation de tranche a été facilement atteint depuis le début des années 1990 3. Cependant, au début de la préparation tranche souvent ne permettait pas la stimulation des racines ventrales. Au meilleur de notre connaissance, seules deux études ont rapporté une stimulation réussie des racines ventrales en tranches transversales, et aucun n'a été obtenu à partir de souris 4,5.
Dans cet article, nous présentons une technique pour obtenir des tranches viables de la moelle épinière de souris néonatale (P2 – P11) dans lequel le pool de motoneurones conserve ses racines au départ ventrales axones. conduitla stimulation de la racine ral déclenche potentiel d'action antidromique de nouveau dans les somas de la piscine du motoneurone sortant de la même racine ventrale. Il excite aussi les cibles collatérales du motoneurone, d' autres motoneurones 6-10 et les cellules de Renshaw 11-13. Étant donné que seuls les motoneurones envoient leurs axones vers le bas les racines ventrales, nous utilisons l'enregistrement des potentiels d'action antidromiques comme un moyen simple et définitive à physiologicaly identifier motoneurones 10.
En plus d'utiliser des critères électrophysiologiques et morphologiques potentiellement non inclusives ou trompeuses pour confirmer l'identité des motoneurones, des études récentes sur les motoneurones de la moelle épinière invoquaient également fastidieuse et chronophage post hoc Colorations 16. Une telle identification est habituellement effectuée uniquement sur un échantillon des cellules enregistrées. D'autres stratégies d'identification reposent sur des lignées de souris dans lequel les motoneurones expriment une fluorescence endogène <sup> 17-19. Cependant, en utilisant des marqueurs codés génétiquement peut être difficile à un jeune âge où l'expression du marqueur est encore variable ou si l'étude exige déjà en utilisant une lignée de souris transgéniques. En variante, l'action antidromique enregistrements éventuels peuvent être effectués en routine sur toutes les souris à partir du début de l'enregistrement de la cellule. Expérimentateurs travaillant sur intactes les préparations de la moelle épinière chez le chat, le rat et la souris, ont utilisé de manière fiable ces techniques d'identification depuis les années 1950, 1,2,20,21. Dans des conditions optimales, nous avons pu obtenir des potentiels d'action antidromiques de la quasi-totalité des motoneurones enregistrées.
En outre, la stimulation de la racine ventrale peut être utilisé de manière fiable pour exciter les autres motoneurones 22,23 ou leurs cibles. les cellules de Renshaw 10,24,25. Nous présentons ici les applications de la stimulation de la racine ventrale sous la forme d'actions antidromique enregistrements potentiels de motoneurone somas, ainsi que l'excitation des cellules de Renshaw.
Protocol
Representative Results
Discussion
tranchage Oblique de la moelle épinière est importante car elle permet une stimulation unilatérale des pools de motoneurones et les cellules de Renshaw à un segment vertébral unique d'une manière fiable, complète et spécifique. En outre, il permet une identification rapide, élégant et non-ambiguë des motoneurones enregistrées. Ensuite, nous allons mettre en évidence les avantages de cette technique par rapport à d'autres méthodes de préparation de tranche, puis nous allons insister sur les piège…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Marin Manuel et Olivia Goldman-Szwajkajzer pour leur aide dans la prise des photos. Les auteurs remercient également Arjun Masukar et Tobias Bock pour la relecture du manuscrit. supports financiers ont été fournis par l'Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), le NIH-NINDS (R01NS077863), la Fondation Thierry Latran (OHEX Project), l'association française de myopathie ( numéro de subvention 16026) et Target ALS sont appréciés. Felix Leroy était le destinataire d'un "Contrat doctoral" de l'Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
Referências
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