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Neurociência

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

Published: September 10, 2016
doi:
10.3791/54517
, ,
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II,RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory,The Francis Crick Institute

Summary

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Abstract

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.

The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Introduction

대부분의 동물들은 주변 환경과 상호 작용하는 화학적 감각에 크게 의존하고있다. 냄새의 감각은 적합한 상대 파트너를 찾아 음식을 평가, 포식자를 피하고 위치에 필수적인 역할을한다. 주 후각 상피 1,2의 Grueneberg 신경절 3, 4, 5, 6 Masera의 중격 기관 및 골코 (vomeronasal) 기관 : 대부분의 포유 동물에서, 후각 시스템은 적어도 네 개의 해부학 적 및 기능적으로 서로 다른 주변 장치 서브 시스템으로 구성된다. VNO 신원, 성별, 사회적 순위 성적 7-10 상태에 대한 정보를 전달하는 화학적 신호를 검출하기에 중요한 역할을 액세서리 후각 시스템 (AOS)의 주연 감각 구조를 포함한다. VNO는 바로 구개 위의 비중격의 기지에 위치해 있습니다. 마우스에서, 그것은 연골 캡슐 11 ~ 13 안에 양자 블라인드 끝 튜브입니다. 기관은 초승달 모양의 중간 감각 epithe 모두 구성VSN을을 항구와 측면에 비 감각 부분의 lium. 모두 상피 사이 좁은 골코 (vomeronasal) 덕트 (14)를 통해 비강에 연결되어있는 점액 가득한 루멘있다. 비 감각 ​​조직에 큰 횡 혈관 음압 15,16 통해 예 VNO 루멘으로 작은 펩티드 또는 단백질과 같은 비교적 대형, 주로 비 휘발성 분자의 진입을 용이하게하기 혈관 펌핑 메커니즘을 제공한다. VNO의 구성 요소는 출생시 존재하고 장기 곧 사춘기 17 전에 성인 크기에 도달합니다. 그러나, 설치류 AOS 이미 청소년의 작동 여부를 18 ~ 20 토론을 계속 될 수 있습니다.

VSN을들은 상피 위치와 그들이 표현 수용체의 종류 모두에 의해 구별된다. VSN을은 수초 축삭과 내강쪽으로 돌출하고 microvillous 돌기 손잡이로 끝나는 하나의 정점 덴 드라이트와 바이폴라 형태를 보여줍니다. VSN 도끼기능 총생의 배측 – 꼬리 끝 부분에있는 연골 캡슐 잎 격막을 따라 상승, 액세서리 후각 망울 (AOB) 21, 22에 소공 질의 판과 프로젝트를 통과 골코 (vomeronasal) 신경을 형성한다. 골코 (vomeronasal) 감각 상피는 두 개의 층으로 이루어져있다 : 꼭대기 층이 내강 측과 항구 V1R- 및 신경 세포를 FPR-RS는 발현의 한 종류지만 모두 모두 가까이에 있습니다. 이 신경 세포는 AOB 23-25의 앞쪽 부분에 G 단백질 α-서브 유닛 G의 αi2와 프로젝트를 같이 발현. G의 αo 함께 더 기저층 명시 V2Rs 또는 FPR-RS1에있는 감각 신경 세포와는 AOB 26 ~ 28의 후방 영역에 자신의 축삭을 보냅니다.

골코 (vomeronasal) 뉴런은 가능성이 소변, 타액 등 다양한 체액으로 분비 및 유체 눈물되어 오히려 작은 semiochemicals 29-33 (V1Rs) 또는 단백질 화합물 34-38 (V2Rs)에 의해 활성화된다 37,39-41 </sup>. 현장 실험에서이 VSN을도 포르 밀화 펩티드 및 각종 항균 / 염증 결합 된 화합물 25,42에 의해 활성화되는 것으로 나타났습니다. 또한, 이종 FPR-RS 단백질 (참조 43 참조) 동종 또는 버릇 음식 소스 (25)의 질병에 대한 검출기 등의 잠재적 인 역할을 나타내는 면역 체계로 표현 FPRs과 효능 스펙트럼을 공유 표명했다.

특정 VSN 집단에서 수용체 – 리간드 관계 및 다운 스트림 신호 계곡을 이해하는 기본은 네이티브 환경에서 기본적인 생물 물리학 적 특성에 대한 자세한 평가입니다. 과거에는, 셀룰러 신호의 분석은 크게 형광 마커 단백질을 30,44-49 coexpressing함으로써 뉴런 정의 집단 표시 유전자 변형 동물로부터 혜택있다. 이 프로토콜에서, 형광 마커와 함께 FPR-RS3를 발현하는 형질 전환 마우스 선 (FPR-RS3는-I-금성)가 사용된다.이 접근법은 급성 관상 VNO 조직 슬라이스 단일 뉴런 패치 클램프 기록을 이용하여 광학적으로 식별 가능한 세포 집단의 전기 생리 학적 분석을 수행하기 위해 이러한 유전자 변형 마우스 균주를 사용하는 방법을 예시한다. 공기 압력 중심의 멀티 배럴 관류 시스템 감각 자극 및 약리 에이전트는 녹음 중, 빠른 가역과 초점 신경 자극하거나 억제 할 수 있습니다. 슬라이스 제제의 전체 세포 레코딩은 셀의 기본 환경에서 고유 특성, 전압 – 활성화 컨덕턴스의 상세한 분석뿐만 아니라, 활동 전위 방전 패턴을 허용한다.

Protocol

모든 동물의 절차는 실험 목적으로 사용되는 동물의 보호 (지침 6백9분의 86 / EEC)와 함께 추천 유럽 실험 동물 과학 연맹 (FELASA)에 의해 제시에 지역 및 유럽 연합 (EU) 법률을 준수했다. C57BL / 6 마우스와 FPR-RS3 – 난 – 금성 마우스 모두 음식과 물을 가능한 광고 무제한와 12 시간 조명 / 어두운주기에 실온에서 남녀의 그룹에 보관 하였다. 실험을 위해 섹스 중 젊은 성인 (6~20주)를 사용 하였다. ?…

Representative Results

정의 된 세포 집단의 생물 물리학 적 및 생리 학적 특성에 대한 통찰력을 얻으려면, 우리는 마우스 VNO (- 2 그림 1)의 급성 관상 조직 조각을 수행합니다. 절개 후, 슬라이스는 몇 시간 동안 빙냉 산소 세포 외 용액 (S 2)에 유지 될 수있다. 녹화 설정에서 신선한 산소 솔루션 일정한 교환 (그림 2D)은 실험을 통해 조직의 생존을 보?…

Discussion

VNO는 semiochemicals을 감지하는 화학 감각 구조입니다. 현재까지, 서 골코 (vomeronasal) 수용체의 대부분은 단지 몇 수용체 – 리간드 쌍은 식별 된대로 deorphanized 일이다. 그 중 V1rb2가 남성 비뇨기 페로몬 2- 헵 타논 (30)에 의해 구체적으로 활성화되도록 설명했다 V2rp5이 남성 특정 페로몬 ESP1 57뿐만 아니라 SYFPEITHI V2r1b과 V2rf2가 MHC 펩타이드에 의해 활성화 될뿐만에 의해 활성화되는 48</…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Materials

Chemicals
Agarose (low-gelling temperature) PeqLab 35-2030
ATP (Mg-ATP) Sigma-Aldrich A9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) Sigma-Aldrich B9879
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Glucose Sigma-Aldrich G8270
GTP (Na-GTP) Sigma-Aldrich 51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 03564
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Surgical tools and consumables
Large petri dish, 90 mm VWR decapitation, dissection of VNO capsule
Small petri dish, 35 mm VWR lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissor Fine Science Tools decapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissors Fine Science Tools cutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2 Fine Science Tools removing skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades  Fine Science Tools cutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 Fine Science Tools dissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatula Fine Science Tools handling agarose block and tissue slices
Surgical scalpel cutting agarose block into pyramidal shape
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amplifier HEKA Elektronik EPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) Science Products
CCD-camera Leica Microsystems DFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 Leica Microsystems I3
Fluorescence lamp Leica Microsystems EL6000
Hot plate magnetic stirrer Snijders 34532
Microforge  Narishige MF-830
Micromanipulator Device  Luigs & Neumann SM-5
Micropipette puller, vertical two-step Narishige PC-10 
Microscope Leica Microsystems CSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) Quest Scientific
Objective  Leica Microsystems HCX APO L20x/1.00 W
Oscilloscope Tektronik TDS 1001B
Osmometer  Gonotec Osmomat 030
Perfusion system 8-in-1 AutoMate Scientific
pH Meter five easy Mettler Toledo
Pipette storage jar World Precision Instruments e212
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Razor blades Wilkinson Sword GmbH Wilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) custom-made
Stereo microscope Leica Microsystems S4E
Trigger interface  HEKA Elektronik TIB-14 S
Vibratome  Leica Microsystems VT 1000 S
Water bath  Memmert WNB 45
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Referências

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Ackels, T., Drose, D. R., Spehr, M. In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ. J. Vis. Exp. (115), e54517, doi:10.3791/54517 (2016).
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