Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para induzir a regeneração do músculo esquelético aguda em ratos adultos e manipulações subsequentes dos músculos, como dissecção, corte, congelação, coloração de rotina e análise de células musculares área de secção transversal.
Abstract
regeneração do músculo esquelético é um processo fisiológico que ocorre em músculos esqueléticos adulto em resposta a uma lesão ou doença. a regeneração do músculo esquelético induzido por lesão aguda é um modelo amplamente usado do sistema, poderoso para estudar os acontecimentos envolvidos na regeneração muscular, bem como os mecanismos e os jogadores diferentes. Com efeito, o conhecimento detalhado deste processo é essencial para uma melhor compreensão das condições patológicas que conduzem à degeneração do músculo esquelético, e auxilia na identificação de novas estratégias terapêuticas dirigidas. O presente trabalho descreve um protocolo detalhado e reprodutível para induzir a regeneração do músculo esquelético aguda em ratos por meio de uma única injecção intramuscular de cardiotoxina (CTX). CTX pertence à família de toxinas de veneno de cobra e provoca miólise de miofibras, que eventualmente provoca os eventos de regeneração. A dinâmica de regeneração do músculo esquelético é avaliada por análise histológica de secções do músculo. O protocolo tambémilustra os procedimentos experimentais para dissecar, congelação, e cortando o músculo tibial anterior, bem como a rotina de coloração com Hematoxilina e Eosina que é amplamente utilizado para a análise morfológico e morfométrico subsequente.
Introduction
músculos esqueléticos mamíferos adultos são formados por grupos de fascículos de células musculares multinucleadas (miofibras) que são especializados para contracção. Cada fibra muscular é um sincício alongado, cercado pelo sarcolema (membrana plasmática) e contendo miofibrilas, que são compostas de proteínas contráteis regularmente e repetidamente organizados (actina e miosina). Na vida adulta e em condições de repouso, músculos esqueléticos têm uma muito baixa rotatividade de seu mionúcleos 1; Com efeito, os mionúcleos, que estão localizados na periferia da fibra muscular, sob o sarcolema, são presos na fase G0 do ciclo celular e são incapazes de proliferar 1,2.
Os músculos esqueléticos têm a capacidade peculiar para regenerar seguinte danos, atingindo homeostase depois de vários eventos de remodelação de tecidos que estão fortemente relacionados uns aos outros. Após uma lesão aguda ou trauma, degeneração é induzida, seguida por processos de regeneraçãoque envolvem diferentes populações de células, incluindo uma população residente de células musculares, as células satélites (SCS). Com efeito, na ausência de quaisquer estímulos ambientais, as células satélites estão num estado de repouso e situam-se num nicho especializado entre o sarcolema e a 3,4 lâmina basal. Na sequência de uma lesão ou doença, a SCS se tornam activadas, proliferam, migram para as áreas danificadas, e, eventualmente, diferenciar-se, dando origem a recém-formadas miofibras 5. SCs ativados estabelecer cross-talk com diferentes populações de células, principalmente células inflamatórias, que são recrutadas no local do trauma 6-8. Este cross-talk permite que as células seguem um paradigma regulamentada pelo qual os sinais moleculares conduzir modificações estruturais, o que levou à homeostase 9. Além SCs, células inflamatórias e intersticiais, processos angiogénicos e eventos re-inervação também estão envolvidos, atuando de forma coordenada para reparar este altamente organizado e sestrutura pecialized.
Há um grande interesse em estudar diferentes aspectos da regeneração do músculo esquelético, não só para compreensão da fisiologia do músculo, mas também para melhorar estratégias terapêuticas que requerem conhecimento mais profundo de todo o processo. Várias abordagens experimentais estão actualmente disponíveis para estudar a identidade e função das diferentes populações de células, as vias de sinalização, e os mecanismos moleculares envolvidos. modelos de rato de lesão aguda representa uma ferramenta poderosa para investigar muitos aspectos deste processo. Diferentes técnicas vulgarmente usadas para induzir lesão muscular aguda permitem acompanhar o processo de regeneração in vivo, a partir das fases muito precoces para o final do processo. Este protocolo descreve os passos da injecção intramuscular de cardiotoxina derivado de veneno de cobra-(CTX), que induz miólise e desencadeia o processo de regeneração, até a análise de amostras de tecido. Após a injecção CTX, MIce pode ser sacrificados em diferentes pontos de tempo, dependendo dos requisitos experimentais, e os músculos esqueléticos podem ser dissecados e processados para análise posterior. Finalmente, descreve-se o protocolo de coloração de secções de tecido para realizar observações morfológicas e análises quantitativas de base. Este protocolo permite o estudo de regeneração do músculo esquelético aguda in vivo de um modo altamente reprodutível 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para induzir lesão aguda no músculo esquelético (ou seja, a injeção intramuscular de CTX). É amplamente utilizado como uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de regeneração do músculo esquelético in vivo. CTX injecção induz a degeneração das fibras musculares, que é causada pela despolarização do sarcolema e a contracção das fibras 12, e desencadeia a cascata de eventos que conduz à regeneração muscular. Os músculos esqueléti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
Referências
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
