El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
La diversidad de pequeños ARN no codificantes (sRNA) se está expandiendo rápidamente y están surgiendo sus papeles en los procesos biológicos, incluyendo la regulación de genes,. Lo más interesante es sRNAs también se encuentran fuera de las células y se presente de forma estable en todos los fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelulares representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y es probable que participan en la señalización celular y las redes de comunicación intercelulares. Para evaluar su potencial como biomarcadores, sRNAs pueden ser cuantificados en plasma, orina y otros fluidos. Sin embargo, para entender completamente el impacto de sRNAs extracelulares como señales endocrinas, es importante para determinar qué compañías están transportando y protegerlos en fluidos biológicos (por ejemplo, plasma), que las células y los tejidos contribuyen a piscinas sRNA extracelulares, y las células y los tejidos capaces de aceptar y utilizar extracelular sRNA. Para lograr estos objetivos, es fundamental para aislar poblaciones altamente puros de portadores extracelularespara sRNA de perfiles y la cuantificación. Hemos demostrado anteriormente que las lipoproteínas, en particular de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), el transporte microARN (miARN) funcionales entre las células y el HDL-miRNAs son significativamente alteradas en la enfermedad. A continuación, detallamos un nuevo protocolo que utiliza tándem aislamiento HDL con ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC) y rápido-proteína-cromatografía líquida (FPLC) para obtener HDL de alta pureza para el perfilado de aguas abajo y cuantificación de todos los sRNAs, incluyendo miRNAs, utilizando tanto alta secuenciación -throughput y enfoques de PCR en tiempo real. Este protocolo será un recurso valioso para la investigación de sRNAs sobre el HDL.
Introduction
No codificante ARN pequeños extracelulares (sRNAs) representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y las posibles dianas terapéuticas y es probable que facilitan la comunicación de célula a célula 1. El tipo más ampliamente estudiada de sRNA son los microARN (miARN) que son aproximadamente 22 nts de longitud y se procesan a partir de formas precursoras más largas y transcritos primarios 2. miRNAs se han demostrado a la post-transcriptionally regular la expresión génica a través de la supresión de la traducción de la proteína y la inducción de la degradación del ARNm 2. Sin embargo, los miRNAs son sólo uno de los muchos tipos de sRNAs; como sRNAs pueden escindirse de ARNt padres (sRNAs tRNA derivados, TDR), pequeños ARN nucleares (sRNAs derivados sRNA, sndRNA), pequeños RNAs nucleolar (sRNAs derivados de ARNsno, snRNA), ARN ribosomal (sRNAs, RDR rRNA derivados ), y ARN (YDR), y otros ARN diverso 1. Unos pocos ejemplos de estos nuevos sRNAs se ha informado de función similar a miRNAs; sin embargo, el fu biológicanctions de muchos de estos sRNAs que queda por determinar, aunque funciones en la regulación de genes es probable 3-6. Lo más interesante, miRNAs y otros sRNAs son presente de forma estable en los fluidos extracelulares, incluyendo la saliva, plasma, orina y bilis. sRNAs extracelulares se probable protegidos de RNasas través de su asociación con vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, y / o complejos de ribonucleoproteínas extracelulares.
Anteriormente, se informó de que las lipoproteínas, a saber, las lipoproteínas de alta densidad (HDL), miRNAs de transporte en el plasma 7. En este estudio, HDL se aisló utilizando un método secuencial de la ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC), cromatografía líquida de proteína rápida (de exclusión por tamaño de filtración en gel cromatografía, FPLC), y cromatografía de afinidad (anti-apolipoproteína AI (apoA-I) inmunoprecipitación ) 7. Con las dos matrices en tiempo real de baja densidad basados en PCR y ensayos de miARN individuales, los niveles de miARN se cuantificaron sobre el HDL aisladas de curartu y 7 sujetos hipercolesterolémicos. Con este enfoque, hemos sido capaces de perfil miRNAs y cuantificar miRNAs específicos en las preparaciones de HDL de alta pureza. Desde 2011, se ha determinado que a pesar de cromatografía de afinidad mejora la pureza del HDL, la saturación de anticuerpos limita en gran medida el rendimiento, y puede ser un costo prohibitivo. Actualmente, el protocolo recomienda un método tándem secuencial de dos etapas de DGUC seguido de FPLC, que también produce muestras de HDL de alta calidad para aguas abajo aislamiento de ARN y cuantificación sRNA. Debido a los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de sRNAs (sRNAseq), por ejemplo, los miRNAs, y el aumento de la conciencia de otras clases no miARN sRNA, sRNAseq es el estado actual de la técnica en el miARN y sRNA perfiles. Como tal, nuestro protocolo recomienda que cuantifican miRNAs y otros sRNAs en muestras de HDL utilizando sRNAseq. No obstante, el ARN total aislado de HDL también se puede utilizar para cuantificar miRNAs individuales y otros sRNAs o validar los resultados sRNAseq usando PCR en tiempo real unapproaches. A continuación se describe en detalle un protocolo para la extracción, purificación, cuantificación, análisis de datos y validación de alta pureza HDL-sRNAs.
El objetivo general de este trabajo es demostrar la viabilidad y el proceso de cuantificación en sRNA HDL altamente puro aislado del plasma humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo está diseñado para cuantificar miRNAs y otros sRNAs por secuenciación de alto rendimiento o PCR en tiempo real sobre el HDL altamente puro. Al igual que con cualquier enfoque, las consideraciones especiales se deben dar a cada paso en el proceso de purificación de HDL y ARN y luego cuantificar sRNAs. Este protocolo está diseñado para los proyectos iniciados con ≥ 2 ml de plasma. Sin embargo, los análisis de ARN de alta calidad con éxito se pueden completar con HDL purificada a partir de tan poco…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
Referências
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
