JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Uygulamaları<em> İn Vivo</em> Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Published: October 07, 2016
doi:
10.3791/54487
, , ,
1Department of Pathology,University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering,University of Virginia, 3Department of Orthopaedic Surgery,University of Virginia

Summary

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Abstract

Iskelet kası, kalıcı, işlevsel ve / veya kozmetik açıkları (örneğin, travmatik yaralanma, hastalık ve çeşitli doğumsal genetik ve edinsel durumlardan kaynaklanan hacimsel kas kaybı (VML) oldukça yaygındır. Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp teknolojileri muazzam sahip rejeneratif kapasitesi olmasına rağmen potansiyel bir terapötik çözüm sağlamak için. Ancak, ilgili fonksiyonel önlemlerin boyuna değerlendirmeler ile birlikte biyolojik ilgili hayvan modellerinin kullanımı VML benzeri yaralanmalarının tedavisinde geliştirilmiş rejeneratif tedavilerin gelişmesine büyük önem taşımaktadır. bu bağlamda, ticari bir kas kolu sistemi uzunluk, gerilme, kuvvet ve iskelet kasında hızı parametrelerini ölçmek için kullanılabilir. Bu ön crural bölmesinin aktivasyonuna yanıt olarak in vivo gücü üretimi ölçmek için yüksek güç, iki fazlı uyarıcı ile birlikte, bu sistem kullanılarak sıçan hindlimb. Biz PREVI varsöndükten tibialis anterior (TA) kas üzerinde VML yaralanma fonksiyonel etkisi, hem de doku mühendisliği kas tamiri (TEMR) teknolojisi ile yaralanan TA kas tedavisi sonrasında fonksiyonel iyileşme ölçüde değerlendirmek için bu ekipmanı kullanılır. Bu tür çalışmalar için, bir anestezi sıçan sol ayak güvenli bir servomotor bağlı bir footplate demirlemiş olan ve peroneal sinir kas kasılmasını ve ayak dorsifleksiyon ortaya çıkarmak için iki perkütan iğne elektrotlar tarafından uyarılır. peroneal sinir uyarımı ile uyarılan kas kasılması pik tetanik kuvvet doğru belirlenmesine izin verir güç üretiminde, nihai plato sağlamak için uyarı frekanslarında (1-200 Hz), bir dizi boyunca ölçülür. VML yaralanma ölçüde yanı sıra tedavisi sonrasında fonksiyonel iyileşme derecesi değerlendirilmesine ek olarak, bu yöntem kolaylıkla kas fizyolojisi ve patofizyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için uygulanabilir. Böyle bir yaklaşım, shokas tamir ve yenilenme için geliştirilmiş tedavilerin daha rasyonel geliştirilmesine yardımcı uld.

Introduction

İskelet kası hasarı veya hastalık 1,2 yanıt olarak tamiri için dikkate değer bir içsel bir kapasiteye sahiptir. Deneysel olarak, bu rejeneratif yanıtta sağlamlığı de, örneğin, inceleyerek hayvan modellerinde belgelenmiştir, myotoxins (ör cardiotoxin) 3-7 uygulanmasından sonra, iskelet kas bozuklukları, tamir ve yenilenme zaman akışı. Daha özel olarak ise, geniş bir cardiotoxin kaynaklı kas bozuklukları, rejenerasyon uydu hücreleri tarafından aracılık edilir (kas lifleri, 8 38-67%), aşağıdaki, yerleşik kök hücreleri nihai olarak fonksiyonel kas lifleri 4,9-13 olmak olgun. Sonuçta post-Zarar sağlıklı, kuvvet üreten kas dokusu 14-16 fonksiyonel yenilenme artar. ayrıntıları bu raporun kapsamı dışında iyi olmasına rağmen, kas rejenerasyonu için mekanik temel canoni kullanan birden fazla soy sayısız hücre tiplerinin dikkatle yönetti olayları yansıtırcal sinyal yolları doku gelişimi ve morfolojilerinden 5,17-21 hem kritik. Önemli olarak, miyotoksin kaynaklı yenilenmesi hücre dışı matris, sinirsel ve damar perfüzyon cardiotoxin kaynaklı kas hasarı 3,8,22, aşağıdaki yapısal olarak sağlam kalır oluşturması ile de mümkündür. tezat olarak, bu anahtar doku yapıları ve bileşenleri, tanımı gereği, VML yaralanma bağlamında tamamen yok; nerede nedenleri çeşitli dolayı doku frank kaybı, kalıcı fonksiyonel ve kozmetik açıkları 23-25 sonuçlanır.

Ne olursa olsun bağlamlarda çeşitli, miyotoksin kaynaklı kas hasarı ile karşılaştırıldığında VML yaralanmayı takiben kas onarımı ve yenilenmesi, iskelet kası yenilenme ve onarım için mekanik temeli geliştirilmiş anlayışı ile ilişkili ek zorluklar, iyi biyolojik kullanımı ile hizmet olacağını uzunlamasına A ile kombinasyon halinde ilgili hayvan modelleriilgili fonksiyonel önlemler ssessments. Bu tarifnamede ele alındığı gibi, sıçan hindlimb çalışmaları bu amaçla için mükemmel bir model sistemi sağlar. Daha spesifik olarak, ayağın dorsifleksiyon sorumlu ön krural bölmesinin kasları (tibialis anterior, ekstansör digitorum longus (EDL) ve hallicus longus (HL)), kolayca tespit ve manipüle. Ayrıca, büyük kan damarlarının (iliak ve şubeler) tarafından sunulan ve bacak 26-28 uzunluğu çalışan sinirler (peroneal dahil siyatik ve şubeler) tarafından innerve edilir. Bunun gibi, biri doğrudan in vivo iskelet kası fonksiyonu / patoloji değerlendirmek için fare hindlimb modelini kullanabilir veya iskelet kası fonksiyonunu gelen kan damarları veya sinirlerdeki patoloji ile ilgili değişiklikler daha dolaylı etkisini değerlendirmek için. Her iki durumda da, hastalığın şiddeti, hem de tedavinin etkinliği kas gücü üretimi (tork) ve karşılık gelen ayak m bir fonksiyonu olarak belirlenebilir29-34 ovement.

İdeal olarak, kuvvet ölçümleri histolojik çalışmalar eşliğinde ve gen ifadesi daha sıkı iskelet kasının yapısal ve moleküler durumunu değerlendirmek için analiz edilir. Temel histoloji ve immünhistokimya, örneğin, kas boyutu, kas lifi hizalama, hücre dışı matriks kompozisyonu, çekirdeklerin konumu, hücre sayısı ve protein lokalizasyonu ile ilgili soruları yanıtlamak mümkün. Gen ekspresyonu analizi, sırasıyla, / etkisini kas lifleri, hastalıkların ve metabolik aktivite vade modüle edebilir moleküler mekanizmaları belirlenmesi için gereklidir. Bu yöntemler önemli bilgiler sağlarken, genellikle, terminal uç noktayı temsil, ve en önemlisi, doğrudan iskelet kasının fonksiyonel kapasiteyi gidermek için başarısız, ve böylece, yerine etken daha bağıntılı bulunmaktadır. Ancak, histolojik çalışmalar ve gen ifadesi analizleri fonksiyonel Ağırlık, hacim, birlikte değerlendirildiğindees, o zaman, kuvvet üretimi ve işlevsel rejenerasyon mekanizmaları en doğru şekilde tespit edilebilir.

Bu bağlamda, bir kas özellikler üreten kuvvet in situ veya de vivo, in vitro, ölçülebilir. Her üç yaklaşım avantajları ve sınırlamaları ikisi de var. Bir in vitro deneyde, örneğin, kas tamamen izole edilir ve hayvanın vücuduna kaldırılır. Kas besleyen kan damarları ve sinirler etkileri ortadan kaldırarak, doku kasılma yeteneği sıkı bir şekilde kontrol dış çevre 35 tespit edilebilir. Yerinde kas testi Bununla birlikte, in vitro preparatları ile, kas izole edilmesini sağlar , innervasyonu ve kan temini bozulmadan kalır. In situ deneysel model yararı innervasyonu ve kan akımı minimal 36 tedirgin ederken bireysel kas incelenecek olanak sağlamasıdır. Hem dein situ deneylerde in vitro ve in, farmakolojik tedavilerin bir çevre dokulara veya ölçüm kasılmaları 37 dolaşım sisteminin etkisi etkileri için gerek kalmadan daha doğrudan tatbik edilebilir. Bununla birlikte, in vivo fonksiyon testleri, burada tarif edildiği gibi, kendi doğal ortamından 38 kas fonksiyonunu değerlendirmek için en az invaziv bir tekniktir, ve (le, uzunlamasına) zaman içinde sürekli olarak gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, aşağıda tartışmanın odak noktası olacaktır.

Bu bağlamda, ilgi konusu kas, ya da karşılık vermektedir, motor sinir takılabilirken perkütan elektrotlar, kas bir elektrik sinyali sağlar. Bir dönüştürücü daha sonra önceden belirlenmiş, özel yazılım protokolü yönettiği gibi aktif kasta bileşke uzunluk veya kuvvet değişiklikleri ölçer. Bu verilerden, kas fiziksel özellikleri tespit edilebilir. Bunlar arasında şunlar yerce-frekans, maksimum tetanos, kuvvet-hız, sertlik, uzunluk-gerilim ve yorgunluk. Kas uzunluğu veya kuvvet de sabit tutulabilir, böylece izometrik veya izotonik kas sözleşmeleri. Önemli olarak, bu deneysel protokoller hızla gerçekleştirilebilir kolayca tekrar ve customized- tüm hayvan anestetize iken ve gün sonrası bir iyileşme süresi ile. Tek bir hayvan böylece hastalık modellerinde veya tedavi edici platformları / teknolojilerin değerlendirilmesi uzunlamasına çalışmalar sağlayarak, birden çok kez test in vivo yürürlükte uğrayabilir.

Bu tarifnamede anlatıldığı gibi, bir yüksek güç ile bağlantılı olarak ticari bir kas kolu sistemi, iki fazlı stimülatörü uyarılması yoluyla ayak dorsifleksiyonda Sıçan arka bacağın bir kaval kemiği ön kasında katkı değerlendirmek için in vivo kas fonksiyonu test gerçekleştirmek için kullanılır peroneal sinir. Biz özellikle rejeneratif tıp / ti değerlendirmek için tasarlanmış bir protokol geliştirdiSıçan TA kas travmatik VML yaralanmayı takiben kas onarımı için ssue mühendislik teknolojileri. Belirtilmelidir; EDL ve HL özellikle (onlar peroneal sinir stimülasyonu (Corona aşağıdaki ölçülen toplam anterior tibial tork yaklaşık% 15-20 hesaba TA kas değerlendirmek amacıyla ön krural bölmenin dışında disseke gereken ark., 2013) ). Bu yaklaşım, kas fizyolojisi / fonksiyonunun kapsamlı boyuna analiz sağlar, çünkü çok sayıda diğer fizyolojik araştırmaların türleri yanı sıra hastalığın çeşitli veya terapötik alanlarda 39 önemli mekanik fikir tutabilir. Örneğin, in vivo kas fonksiyon testleri egzersiz fizyolojisi, iskemi / reperfüzyon araştırma, miyopati, sinir hasarı / nöropati ve vaskülopati, sarcopenia ve müsküler distrofi 40 çalışmaları için geçerlidir.

Protocol

Tüm hayvanlar insanca muamele edildi ve tüm protokoller Virginia IACUC Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Ekipman Hazırlığı tüm makineleri düzgün şekilde bağlandığından emin olun. yüksek güç iki fazlı uyarıcısı ve dual-mode kolu sistemi ile takip bilgisayarı açın. Şu anda,% 2 izofluran ile anestezi verilen odasına hayvan yerleştirin ve bir platform 37 ° C'ye kadar ısıtılır ve böylece ısıtma elemanı açın. politetrafloroetilen (PTFE) kaplı uçları batık ve cihaz ve yazılım kurma sırasında dezenfekte edilecek, böylece% 70 etanol içinde elektrotlar yerleştirin. Bulun ve masaüstünde kolu sistemi kontrol yazılımı açın. NOT: Bu fonksiyonel test gerçekleştirmek için gereken yazılım olacaktır. 2. Yazılım Kurulumu Program (Şekil 1A) açıldığında, parametreyi değiştirmekistenen değerlere Kurulum menüsü altında Anında Stim için s. NOT: Bu protokol, tüm parametreler 180 sn (Şekil 1B) olarak değiştirildi "çalışma süresi (ler)", dışında önceden belirlenmiş seviyelerde kalır. Kurulum menüsü altında bir otomatik kaydetme klasör oluşturun. "Otomatik Kaydetme Bankası" etiketli bir tip güçlü penceresini bulun. Girdi numunenin adı, örneğin "Rat1-tarih-timepoint". Doğrudan "Otomatik Kaydetme Base" tip güçlü pencerenin solunda, "Otomatik kaydetme etkinleştirin." Kutusuna tıklayın Kontrol Ekranının üst kısmında, "Sequencer" seçeneğini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır. yeni pencerenin alt kısmında, "Açık Sırası" seçeneğini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır. premade dizisini seçin ve Tamam'a tıklayın. Dizi sıklığı da dahil olmak üzere parametrelerin, uyaranlara süresi ve dinlenme süresi ile bir protokol listesi adlı pencerede gelişecektir: Dizi Editörü (Şekil 1C). "Load Sırası" Click -> & #34; Pencereyi Kapat ". > "Canlı Data Monitor" – gerçek zamanlı akım ve stimülasyon görmek için, "Dosya" seçeneğini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır. Yeni Canlı Veri penceresinde, ekranda maksimum ve minimum y-değerleri girin elle autoscale işlevini kullanarak, ya da test için biçimlendirme ekranı. 3. Hayvan Set-up NOT: Tüm kuvvet ölçümleri 11 haftalık Lewis sıçan olanlardır. kas kütlesi ve (Newton cinsinden) kuvvet üretimi arasında doğrusal bir ilişki vardır. Bu nedenle, sıçan artar yaş gibi, bacak tarafından üretilen kuvvet değerleri de artmalıdır. Hayvan anestezi odasından çıkarmadan önce anestezi uygun düzlemde olduğundan emin olun. Tamamen ayak bileği ve elektrikli saç kesme makinesi kullanılarak deneysel bacak pelvis arasındaki yanal tarafında tüm tüylerden. NOT: Anestezi doğru düzlem elde edildiğinde hayvan iBir ayak tutam duyarlı olmayan s. Her kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından öne sürülen yönergeleri takip etmek gereklidir. anestezi yeterli derinlikte kalır, böylece hayvanın burun güvenli anestezi burun konisi içinde sağlanması yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. Üç bağımsız düğmeleri (Şekil 2) ile pedal aygıtının konumunu düzenler. düğmelerini (A ve B) kullanılarak, ayak pedalını ayarlamak sırasıyla onun kadar sol ve en düşük konumda pedal cihazı yerleştirmek için. Daha sonra manipülasyonları için oda bırakarak bu hayvanın ayağının doğru konumlandırılmasını sağlayacak. Bu pozisyonda, hayvan bacak düz bir düzlemde yatıyor böylece doğru ya da daha uzak deneyci gelen iki cihazı taşımak için pistin sol tarafta düğmesini kullanın. iyot ve alkol üç değişikliklerle bacak temizleyin. iyot 30 saniye boyunca bacak kalmalıdır. hayvan veya platformu ayarlama(Şekil 2A, D) genişletilmiş bacak ayak taban ve ayak pedalı arasında tam temas sağlar, böylece. Tıbbi bant kullanarak, ayak plakası (Şekil 2B) karşı hayvanın ayağını sabitleyin. Topuk pedalı ve tüm ayak tabanına karşı hizaya düz ve test sırasında plaka yerinden olmaz önemlidir. bacak stabilize etmek için sıkma mekanizması bulun. Allen anahtarı çevirerek bacak hareketi azaltmak ve yerine kilitlemek için yeterince stabilize pimini itin. Bu pozisyonda, doğru ya da uzağa deneyci gelen iki cihazı taşımak için topuzu C kullanın, böylece düz bir çizgi (Şekil 2C) ayak bileği, tibia ve femur yalan. Bacak Ayak pedalı ile paralel olduğundan emin olun. Ayak ve tibia 90 ° pozisyonunda böylece yavaş ayak bileği hareket etmek, elbette ve aparatın arkasında bulunan ince kolları üzerinde ayarlamalar yapın. continue femur böylece bacak hareket etmek ve Tibia 90 derecelik bir dik açı (Şekil 2B) yer almaktadır. Bu noktada, hayvan elektrotları için hazırdır. Elektrotlar 4. Yerleştirme "Anında Stim" etiketli turuncu butonuna tıklayarak "Anlık buyar" etkinleştirin. tibialis anterior proksimal ucunda yüzeysel hem elektrotlar yerleştirin ve sivri canlı monitörde görülür dek etrafında elektrot uçları taşıyın. İdeal olarak, ani 0.4 N civarında olmalıdır Not: elektrotlar da, tibia diz dik yanal olarak çalışan peroneal sinir düzlemine bitişik ve dik yerleştirilmelidir. delmek dermis yeterince ve zorlukla kas tabakası içine bir iğne takın. ani 0.6 N. takın iğne etrafında canlı monitörde görülür kadar etrafında diğer elektrot hareket ettirin ve bir hobi kelepçe veya tıbbi bant kullanarak yerine bunları kelepçe. birdjust kaba ve ince ayarlamalar maksimal kuvvet çıkışı bulmak için. yüksek güç iki fazlı stimülatörü, merkezde iki düğme olacaktır. Bir "RANGE" etiketli ve diğer "ADJUST" dir. istenen maksimum amper için "RANGE" düğmesini çevirin. NOT: zirveleri yavaş yavaş büyüklüğü artacak ve maksimum amper arka arkaya üç uyaranlar aynı kasılma yanıtlarına neden hangi seviyede olduğu tespit edilmiştir. gerekenden daha amper yüksek dönme Resist; Maksimum amper sözleşme tüm kas teşvik edecek, ancak herhangi bir yüksek akım komşu kasların işe neden olur ve potansiyel olarak antagonistleri. kas uyarmak için kullanılır "RANGE" yüzdesini ayarlamak için "AYAR" düğmesini çevirin. Bu noktada, kuvvet etrafında 1.0 N okumalısınız Bu akım bir artış ya da azalma gerektirebilir. onlar güvenli olduğundan emin olmak için elektrotlar tekrar kontrol edin. DurAnında Buyar. "Canlı Veri" penceresinde, "Sırası başlayın." Tıklayın geri Kontrol Ekranı gidiyor ve turuncu "Anında Stim" butonuna üstünde yer alan "Analiz" butonuna tıklayarak eğrileri izlemeye devam edin. tetanik eğri 60 Hz stimülasyon etrafında şekil almaya başlamalıdır. 5. Uyarım ve Clean Up tamamlanması dizisi bittikten sonra, elektrotları çıkarın ve% 70 alkol ile silin. kapakları elektrotlar yerleştirin. Diz kelepçesini gevşetin ve anestezi kapatın. Anestezi gazı hayvan çıkarın ve ısıtma yastığı hala pozisyonda hayvan yerleştirin. Izofluran gaz oksijenli sıçan tutmak için kapatıldıktan sonra birkaç dakika için% 100 O 2 sıçan koruyun. Hayvan başlangıçta hareket edebilir, ama hayvan bilinci yerine gelene kadar hayvan kafesine geri dönmez. kas ağrısı fark edilmesi halindehayvan bakımı komitesi tarafından belirtilen iyileşme üzerine, NSAID dozu verilmelidir. Adım 1.2 listelenen tüm donanımları kapatın, yazılım kapatın ve veri analizi devam etmektedir. Platform ve ayak pedalını aşağı doğru silin. 6. Veri Analizi Not: Veri analizi Bu laboratuar tarafından tasarlanan ve laboratuar protokollere göre bir sekans uygun gerçekleştirilir. Analiz değerleri, önem veri noktaları ve prosedürün diğer yönleri kullanıcının niyet bağlı değişecektir. veri analiz yazılımı açın. Bir anda birden fazla veri dosyaları (örnek) analiz sağlamak için Yüksek Verimli menüsünü tıklayın. "Kuvvet Frekans" Analizi seçin. "Dosya Seç" butonuna tıklayın ve istediğiniz gibi birçok kaydedilen veri dosyaları açmak. İmleç Yerleştirme Yöntemi kutusunda "Manual" seçeneğini seçin. NOT: Bu kullanıcı dat tüm analiz sağlayacakBir istenen zaman damgası içinde, programa karşı otomatik olarak analiz konumu seçin. 2. End İmleç zaman damgası değerini değiştirin "Analiz" düğmesine (Şekil 1D) tıklayın. tabloyu kaydetmek ve bir elektronik tablo kullanarak verileri analiz, düğme ACSII için "Kaydet Tablo tıklayın. Bu dosyayı kaydetmek olacak ve daha sonraki bir zamanda bir tablo ile açılabilir. e-tabloya kaydedilen veri dosyasını açın. "Mutlak Maksimum" etiketli ek bir sütun oluşturun ve başlangıçta ve her numune için maksimum değerleri arasındaki farkı belirler. Bu, her frekansta üretilen toplam maksimum kuvvet sağlayacaktır. tork belirlemek için, manivela kolunun uzunluğu her kuvvet değerini çarpın. NOT: Bu durumda, o hayvanın ayak uzunluğu ile temsil edilecektir. Bu protokol, 30 mm ortalama deneysel olarak belirlenen bir değer kullanır. Kullanıcı artık ma değerleri belirlemiştirHer frekansta üretilen ximum tork. bir tork frekans eğrisi, ya da, tüm stimülasyon frekansları arasında hayvan tarafından üretilen maksimum tork olarak bu değerleri grafik. NOT: Bu tanımlanmış ve numuneler arasında karşılaştırılması, tek bir nokta olarak kullanılabilir.

Representative Results

tetanik eğri sub-optimal sonuçları en iyi sonuçları ayırt etmek için kullanılabilir. Bu eğri, genellikle 60 Hz bir frekansta oluşmaya başlar. İyi sonuçlar elde etmek için önemli bir faktör bunun maksimal kuvvet oluşturur ve tetanos sırasında kuvvet tutar, böylece kas uyarma yeteneği. İdeal eğri az salınımlar ile düz bir plato fazının ardından uyarılması sırasında kesintisiz, keskin dikey yükseliş, ve stimülasyon bitiminde kesintisiz, keskin dikey düşüş dönemi (Şekil 4) sahip olmalıdır. İdeal eğri sapmalar kas yorgun bir göstergeler (Şekil 5D) ya da kas doğru maksimum gücü oluşturmak için uyarıldıktan olmadığı (Şekil 5B – C). İkincisi genellikle stimula sırasında kas liflerinin maksimum işe yetmezliğine yol açan yanlış elektrot yerleştirme sonuçlarıyon. kas tetanik eğri (sigortalı) tam veya (sigortasız) eksik olsun veya olmasın bir ideal olmayan eğri yanlış elektrot yerleştirme veya patolojik değişikliklerin sonucu ise araştırmacı sağlayan bir ayırt edici özelliği belirler. Bir füzyonlu olmayan, eksik tetanik eğri kas maksimum bir kasılma karşılaşmayan sonuçlanan elektrotlar yanlış olduğunu gösterir. kontrol, ya da daha hızlı bir şekilde yorar kasılabilir yanıtı ile karşılaştırıldığında, maksimum küçülmeyi azalmış kas patolojik değişikliğin bir örneği görülmektedir. Bu prosedürün boyunca elde edilen piklerin üç farklı türde, farklı elektrot ve bacak pozisyonları temsil ve Şekil 3'te görülebilir. İlk zirveleri 0.4N etrafında ve doğru elektrot yerleştirme cilt (Şekil üzerinde yüzeysel tespit edildiğinde ortaya çıkar Şekil 3A). piklerin ikinci seti h vardırigher genliği, genellikle yaklaşık 0.5-0.6N (Şekil 3B) ve elektrotların dermisinden delip ortaya çıkar. Elde edilen bu sonra, bacak ve ayak elde edilir kuvvet üretimini maksimize etmek için ayarlanabilir olduğunda, yaklaşık 1 N ya da daha fazla (Şekil 3C) tepe genlik artar. Bu noktada, Anında Stim kapatılabilir ve dizi başlayabilir. Bu kılavuzlar doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak ve protokol boyunca önemli kontrol noktaları vardır. nihai sonuçlar kullanıcı kuvvet testi ve deneysel tasarım çıkarılan bilgilere bağlı olarak farklı şekillerde temsil edilebilir. Bu protokol, maksimum kuvvet stimülasyon frekanslar arasında ölçülür, bununla birlikte diğer veri noktaları, belirli bir araştırmacı ya da uygulama için önemli olabilir. Bir örnek tetanik eğri şekil almaya başladığı stimülasyon sıklığıdır. To veriler aynı hayvan üzerinde, ya da farklı tedavi grupları arasında karşılaştırmalar için bir önceki ya da sonraki deneyde elde edilen diğer sonuçlara mukayese edilebilir. Kuvvet üretimi izometrik kuvvet hesaplamak ve gözlenen maksimum kasılma üzerine yaşın etkisi daha tarafsız bir değerlendirme sağlamak için vücut kütle olarak normalize edilebilir. farklı vücut ağırlığı ve yaş hayvanlar çeşitli maksimum güçleri üretecek rağmen prosedür doğru yapıldığında, tetanik eğrisinin şekli, tüm gruplar arasında tutarlı olmalıdır. Şekil 1: Kol sistemi Kontrol ve Analizi Veri Analizi Yazılım Genel Bakış kontrol yazılımı (A) Genel programı açılması.. (B) Parametreler "Anlık Stim." Kuvvet frekans uyarımı için (c) Örnek sekansı. (D </stRong>) analiz yazılımında bir yüksek verimli güç frekans analizi Temsilcisi verileri. Örnek sırası ve veri analizi prosedürü bu protokole özgü ve bu yazılım tarafından sağlanan dizilerin ve çıkışların tam kapsamlı temsil etmediğini belirtmek gerekir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2:. Cihazında Ayak Rat Konumlandırma ve Yerleştirme (A) Kritik Yönleri sıçan güvenli footplate bağlı sol ayağı ile yatar pozisyonda olduğunu. ayak, bacak ve uyluk tarafından yapılan dik açılar çember vardır. (B) ayak bileği tarafından oluşturulan dik açı vurgulanır. (C) bacak gerekir ayak vücuda düz bir düzlemde aynı hizada. (D) elektrot yerleştirme paralel ve peroneal sinirin düzlemine diktir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: Temsilci Peaks Maksimum Kuvvet Üretime Doğru Elektrot Yerleştirme Önemi gösterilmesi çok yüzeysel yerleştirilen elektrotlar ile gözlemlenen (A) Baseline zirve tetanik tepkiler.. (B) doğru yerde takılı elektrotlarla büyük zirveleri. Bacak ve ayak pozisyonları optimal öncesi dizisi tepe genlik doğru elektrot yerleştirme sinyalizasyon büyük tepelerinden (C) Geçiş optimum ayarlanır./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4:. 100 Hz Optimal Tetanik Eğrisi Bu eğri artar ve hızla azalır ve düz plato fazı vardır. Bu örnek, doğru elektrot yerleştirme ve maksimal kuvvet uyarımı gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5:. 100 Hz elde Alt optimum Tetanik Curves Temsilcisi örnekleri (A) gevşeme ardından, bu eğri taban altında dips. Bu uyarım göstergesidirantagonist. (B – D) Bu grafikler uygunsuz elektrot yerleştirme ve kas liflerinin eşitsiz işe sonucudur. Plato evreleri, büyük salınımlar (B), bir yukarı eğim (C), ya da aşağıya doğru bir eğim (D) göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu protokol sıçan hindlimb anterior krural bölmesindeki in vivo kas fonksiyonu test gerçekleştirmek için nispeten basit bir yöntemi gösterir. Ex vivo dahil ve in situ protokolleri, aynı zamanda kas fizyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir kas fonksiyon testleri diğer formları. Ancak, in vivo fonksiyon testi önemi olan invazif olmayan doğası yatıyor ve en doğru şekilde kas stimülasyonu endojen mekanizmalarını özetlediği gerçeği. Her iki ex vivo ve in situ testi, tendon ve / veya kas maruz kalmakta ve bu yüzden, nemli tutulur ve 41,42 batırılmış olmalıdır. In vivo testi gerekli cerrahi işlemler neden olabilir travma ve inflamasyon karıştırıcı değişkenleri ortadan kaldırır in situ kas fonksiyonu test; Deneyin amacı, inflamatuar ve hücresel süreçleri araştırmaktır, bu özellikle önemlidir <s> 43 kadar. Ayrıca, in vivo testleri kas çevresi izole değildir ve kas / tendon kaymayı azaltmak için tam olarak düğüm gerektirmez küçük bir cerrahi beceri gerektirir 41 (olduğu gibi in situ ve ex vivo test). Buna ek olarak, yeterli uygulama ile, doğru elektrot yerleştirme hızı ve hızlı bir şekilde bu protokol tamamlama hızlı olmasını sağlamak ve hayvanların içinde ve aynı ekipman 39 farklı kullanıcılar arasında hem reproducible- edecek kas maksimal kuvvet üretimini sağlamak için ayarlamalar yapmak için yetenek . Önce TA kas daha doğrudan soruşturma için daha az erişilebilir sinerjik kaslar (EDL ve HL) eksizyonu için, gösterildiği gibi tüm ön krural bileşenin bir değerlendirme ile başlamak faydalıdır. Bu yaklaşımı kullanarak, tek bir çok hızlı bir şekilde teknik ustalığı elde edilebilir. Burada açıklanan prosedür gösteren ve bir kuvvet fr yararını ışık tutmaktadırequency protokolü kas tarafından üretilen maksimum kuvvet tetanos neden ve belirlemek için, kullanıcıların en iyi kendi özel deneyi (ler) ve araştırma hedeflerini bilgilendirmek fonksiyonel test türünü (ler) belirlemelidir.

dikkatle stimülasyon parametreleri çeşitli kas, optimal ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar sağlamak için, yani tutarlı maksimal kuvvet üretimi yapılmalıdır birçok kritik adımlar vardır. Temel özellikleri çeşitli Şekil 2'de özetlenmiştir. Bununla birlikte, uygun bir yerleşim ve teşvik edici elektrot stabilitesi peroneal sinir tekrarlanabilir maksimum uyarılması için mutlak bir ön koşuldur. Bu bağlamda, elektrotlar yüzeysel yerleştirilmelidir. Bu elektrot yerleştirme çok derin ise, bir nedenle ön krural bölmenin gözlenen kasılma tepkisinin büyüklüğünü azalan, antagonist kasların doğrudan elektriksel uyarımı riskler vardır. Bundan başka,iki elektrot çevresindeki deri ve bağ dokusu elektrik direncini azaltmak için uygulanabilir olarak birbirine kadar yakın yerleştirilmelidir. Genel olarak, doğrudan bu gastroknemius buluştuğu için tibialis anterior kenarından izleme bacak diz yakın ve medial elektrot yerleştirme genellikle yeterli kuvvet üretimini verir. Bu aynı zamanda elektrotlar da, tibia dik ve yanal diz bacak aşağı çalışır peroneal sinirin, düzlemine bitişik ve dik yerleştirilmiş olmasını sağlar. Ancak, hayvanlar arasındaki anatomi doğal değişkenlik o elektrot yerleştirme vaka tarafından ayrı ayrı optimize edilmiştir sağlamak için sürekli dikkat gerektirir. Bu nedenle, önemli ölçüde kullanıcı deneyimi ile azalır elektrot yerleştirme ile ilgili deneme yanılma belirli bir düzeyde bulunmaktadır. Beni azalır elektrotlar cilt şişme ve iltihaplanmayı azaltmak için minimize edilmelidir delmek sayısı,asured kuvvet üretimi. Bu iğneler ilk yerleştirildiği bağlıdır, ancak dizkapağı çevresindeki alanda daha özel olarak iğnelerin, iki kez geçmek ya da tavsiye edilir. Elektrotlar hayvanın ayağı yerleştirilir sonra, son olarak, küçük ayarlamalar bacak konumlandırılması ve elektrotlar ile gönderilen akım yapılabilir. eş zamanlı olarak tek bir seğirme üretilen kuvvet izleme sırasında bu yapılmalıdır. elektrot yerleştirme ek olarak, ayarlamalar elektrotlar boyunca verilen gerilime yapılabilir. Ancak, burada açıklanan kurulumunda, kuvvet üretimi artırmak için bir yol olarak gerilimi artırırken artan gerilim innerve antagonist kaslar sinirleri uyarmak çünkü dikkatli kullanmak önemlidir.

elektrot yerleştirme optimum kalmasını sağlamak için izlenmesi gereken üç temel teknik endişeleri vardır. İlk olarak, anestezi hayvanın ayak güvenli olmalıkas gücü üretimini (Şekil 2) ölçen ayak pedalı aygıtına demirledi. Ayak güvenli demirlemiş değilse, kas tarafından üretilen gerçek gücü eksik kuvvet dönüştürücü çevrilemez. Kararsız ayak sabitleme normal kas kasılması ötesinde hareket olarak elektrotlar optimal yerleştirme kaybetme riskini getirmektedir (yani uzak footplate hareketli ayak) kendi yüzeysel pozisyondan elektrotların değiştirmesine neden olabilir ya da onları tamamen çıkarmak. Ya senaryo ölçülen kuvvet azalacaktır. İkinci olarak, hayvanın vücut tamamen yatar ve düz bir düzlemde (Şekil 2) hizalanmış olmalıdır. hayvanlar vücudun doğru konumlandırılması nedeniyle solunum bacak hafif hareketlerini engeller ve aynı zamanda daha iyi bir yerleşim ve uyarıcı elektrotların sürekli temas sağlayarak, bacak ve pelvis büküm en aza indirir. diz Üçüncü olarak, doğru konumlandırma ve demirleme great.Thanks olduğunuCAL bacak sabit kalmasını sağlamak ve böylece peroneal sinir bir geçiş izin vermek için uyarıcı elektrotlar için optimal bir yerleşim stabilize yardımcı olur.

üzerinde durulması gereken bir kaç ek puan vardır. İlk olarak, ticari kas kol sistemi sol bacak üzerinde test gerçekleştirmek için tasarlanmıştır, ancak kurulum yanı sıra sağ bacak üzerinde test yapmak için modifiye edilebilir. Kullanıcılar kullanılan platform ölçülmesi ve seçim hayvan modeli ile üretilen kuvvet desteklemek için yeterli olduğundan emin olmak gerekir, böylece ikinci kas kolu sistemi, hayvan büyüklüğüne göre seçilebilir. Ekipman platformu için test edilebilir kas ayağın plantar uzantısı veya dorsifleksiyonun neden olanlar ile sınırlıdır. Üçüncüsü, yine elektrot yerleştirme zor olabilir ve sabır gerektirir ve tekniğe hakim pratik yapabilirsiniz vurgulanmalıdır. Elektrotlar da düzenli kullanımı ile hızlı bir şekilde sıkıcı hale, yani birkaç yedek s olması yararlı oluro yüzeysel cilt prick zor olur bir kez ets. Üçüncü olarak, bu raporda açıklanan protokole özgü stimülasyon dizileri ve veri analiz yöntemleri kullanır. kas kolu sistemi kontrol yazılımı ve veri analiz yazılımı ve diğer pek çok deneysel soru ve bu nedenle cevap verebilir sağlayan veri, onun yarar burada özetlenen ne ötesine uzanır. Bu nedenle, kullanıcıların bu makalede sunulan yazılım protokolü (ler) sınırlarının ötesine keşfetmek için teşvik edilir. Bu küçük kısıtlamalara rağmen, in vivo kas fonksiyon testleri o minimal invaziv ve aynı hayvan üzerinde, uzun bir zaman dilimi boyunca, birden çok kez yapılabilir, çünkü iskelet kasının sağlık ve kasılma yeteneğini belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Kısacası, hizmete yarar bu tür sıçan hindlimb iskelet kası hasarı veya hastalığı için yeni tedavilerin etkilerini test sistem özellikle usta yapar.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.

Materials

Isothesia Henry Schein Animal Health 05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill Vet Equip 911103
Inlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911124
Outlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911125
Tabletop Anaesthesia Machine Vet Equip 901801
Compressed oxygen gas Praxair N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter Vet Equip 931401
T/Pump Professional water heater Stryker N/A set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape 3M 1527S-1 rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers Oster 078005-050-002
Povidone-Iodine Solution Aplicare 82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol Decon labs diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators Puritan 836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode Chalgren Enterprises 111-725-24TP
servomotor Cambridge Technology Model 6650LR
Dual Mode Lever System Aurora Scientific Inc Model 305C-LR-FP contact manufacturer to order
Signal Interface Aurora Scientific Inc Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc Model 701C
Data analysis software Aurora Scientific Inc DMAv5.110 software
Muscle lever system control software Aurora Scientific Inc DMCv5.400 software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
  2. Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
  3. Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
  5. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
  6. Couteaux, R., Mira, J. C., d’Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
  7. d’Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
  8. Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
  9. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  10. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
  11. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  12. Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
  13. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
  14. Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
  15. Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
  16. Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
  17. Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
  18. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  19. von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
  20. Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
  21. Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
  22. Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
  23. Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
  24. Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
  25. Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
  26. Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
  27. Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
  28. Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
  29. Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371 (2014).
  30. Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
  31. Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
  32. Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
  33. Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
  34. Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
  35. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198 (2012).
  36. MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167 (2011).
  37. Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
  38. Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246 (2011).
  39. Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
  40. Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37 (2011).
  41. Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
  42. Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
  43. Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).

Tags

In Vivo Functional TestingRat Tibialis AnteriorMuscle Function TestingMuscle Damage And RecoveryMuscle RegenerationMuscle Mass And ForceAnesthesiaRat PositioningElectrode PlacementFoot PedalLeg Stabilization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. J. Vis. Exp. (116), e54487, doi:10.3791/54487 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image