We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.
Trotz der Regenerationsfähigkeit der Skelettmuskulatur, dauerhafte funktionelle und / oder kosmetische Defizite (zB Volumen Muskelschwund (VML) , die aus einer traumatischen Verletzung, Krankheit und verschiedene angeborene, genetische und erworbene Bedingungen sind durchaus üblich. Tissue Engineering und der regenerativen Medizin Technologien haben ein enormes Potential einer therapeutischen Lösung. jedoch Verwendung von biologisch relevanten Tiermodellen in Verbindung mit Längsabschätzungen von relevanten funktionalen Maßnahmen sind entscheidend für die Entwicklung verbesserter regenerative Therapeutika zur Behandlung von VML-ähnlichen Verletzungen. in dieser Hinsicht, ein Handelsmuskelhebelsystem zu messen Länge, Spannung, Kraft und Geschwindigkeit Parameter in der Skelettmuskulatur verwendet werden. Wir haben in Verbindung mit einer hohen Leistung, Bi-Phasen – Stimulator, dieses System, in vivo Kraftproduktion in Reaktion auf die Aktivierung des vorderen cruris Raum zu messen von die Ratte hindlimb. Wir haben PREVIlaufend dieses Gerät verwendet, um die funktionellen Auswirkungen von VML Verletzung an der tibialis anterior (TA) Muskel, sowie das Ausmaß der funktionellen Erholung nach der Behandlung des verletzten TA Muskel mit unseren Tissue Engineering Muskelreparatur (TEMR) Technologie zu beurteilen. Für solche Studien ist der linke Fuß einer anästhesierten Ratte sicher an einer Fußplatte mit einem Servomotor verbunden verankert ist, und der gemeinsame peroneal Nerv durch zwei perkutanen Nadelelektroden stimuliert Muskelkontraktion und Dorsalflexion des Fußes hervorzurufen. Die peroneal Nervenstimulation induzierte Muskelkontraktion wird über einen Bereich von Stimulationsfrequenzen (1-200 Hz) gemessen, eine eventuelle Plateau in Kraft Produktion zu gewährleisten, die für eine genaue Bestimmung der Spitzen tetanischer Kraft ermöglicht. Zusätzlich zur Bewertung des Ausmaßes der Schädigung VML sowie dem Grad der funktionellen Wiederherstellung nach der Behandlung kann diese Methodik leicht zu untersuchen diverse Aspekte der Muskelphysiologie und Pathophysiologie angewendet werden. Ein solcher Ansatz shomit der rationelleren Entwicklung verbesserter Therapeutika für Muskel-Reparatur und Regeneration ULD unterstützen.
Der Skelettmuskel hat eine bemerkenswerte Fähigkeit für eine Reparatur in Reaktion auf eine Verletzung oder Krankheit 1,2. Experimentell hat sich die Robustheit dieses regenerative Reaktion wurde in Tiermodellen durch das Studium, beispielsweise der zeitliche Verlauf der Skelettmuskelschäden, Reparatur und Regeneration nach dem Auftragen von myotoxins (zB Cardio) 3-7 gut dokumentiert. Genauer gesagt, wird die Regeneration von Satellitenzellen reifen die Bewohner Stammzellen vermittelt nach umfangreichen Cardio-induzierte Muskelschädigung (38-67% der Muskelfasern 8), die letztlich funktionelle Muskelfasern 4,9-13 geworden. Das Endergebnis ist eine erhöhte post Schaden funktionelle Regeneration gesunder, krafterzeugende Muskelgewebe 14-16. Obwohl die Einzelheiten weit über den Rahmen dieses Berichts sind, spiegelt die mechanistische Grundlage für die Regeneration der Muskeln, die sorgfältig orchestrierten Ereignisse zahlreicher Zelltypen aus mehreren Linien canoni Verwendungcal Signalwege kritisch sowohl auf die Gewebeentwicklung und Morphogenese 5,17-21. Wichtig ist, dass Myotoxin induzierte Regeneration durch die Tatsache ermöglicht , dass die extrazelluläre Matrix, Cardioinduzierte Muskelschäden 3,8,22 folgenden neuronalen Innervation und Blutgefäß Perfusion strukturell intakt bleiben. Im krassen Gegensatz dazu diese Schlüsselgewebestrukturen und Komponenten sind per Definition im Rahmen der VML Verletzung gänzlich fehlen; Wo Frank Gewebeverlust aufgrund einer Vielzahl von Ursachen, führt zu einer dauerhaften funktionellen und kosmetischen Defizite 23-25.
Unabhängig von den zusätzlichen Herausforderungen im Zusammenhang mit Muskel-Reparatur und Regeneration nach VML Verletzungen im Vergleich zu Myotoxin-induzierte Muskelschäden, ein besseres Verständnis der mechanistischen Basis für Skelettmuskelregeneration und Reparatur, in einer Vielzahl von Kontexten, sind gut durch die Nutzung von biologisch serviert relevanten Tiermodellen in Kombination mit Längs einssessments einschlägiger funktionellen Maßnahmen. Wie hierin diskutiert, Studien der Ratte hindlimb zu diesem Zweck ein ausgezeichnetes Modellsystem bereitzustellen. Genauer gesagt, werden die Muskeln des vorderen crural Fach (tibialis anterior, Extensor digitorum longus (EDL) und hallucis longus (HL)), die für die Dorsalflexion des Fußes verantwortlich sind, leicht identifiziert und manipuliert werden können. Darüber hinaus sind sie von den großen Blutgefäßen (Becken und Zweige) serviert und werden von Nerven (Ischias und Niederlassungen, darunter peroneal) über die gesamte Länge des Beins 26-28 innervated. Als solche kann man die Ratte hindlimb Modell verwenden , um direkt Skelettmuskelfunktion / Pathologie in vivo zu bewerten, oder die mehr indirekte Auswirkungen der Pathologie bedingten Veränderungen in Blutgefäßen oder Nerven auf entsprechenden Skelettmuskelfunktion zu bewerten. In jedem Szenario kann die Schwere der Krankheit, sowie die Wirksamkeit der Behandlung als eine Funktion der Muskelkrafterzeugung (Drehmoment) und entsprechenden Fuß m bestimmt werden,29-34 ovement.
Idealerweise werden Kraftmessungen durch histologische Untersuchungen begleitet und Genexpressionsanalysen rigoroser die strukturellen und molekularen Zustand der Skelettmuskulatur zu bewerten. Grund Histologie und Immunhistochemie, beispielsweise in der Lage, Fragen zu Muskelmasse, Muskelfaserausrichtung, extrazelluläre Matrixzusammensetzung, die Lage der Kerne, Zellzahl und Proteinlokalisierung zu beantworten. Genexpressionsanalyse, die wiederum notwendig ist, um die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Reife der Muskelfasern, Krankheitszustände, und die metabolische Aktivität beeinflussen kann / modulieren. Während diese Verfahren entscheidende Informationen liefern, stellen sie im Allgemeinen Terminal-Endpunkte, und am wichtigsten, versagen sie direkt auf die Funktionsfähigkeit der Skelettmuskulatur zu behandeln, und sind somit eher als Korrelat ursächliche. Wenn jedoch histologische Untersuchungen und Genexpressionsanalysen werden in Verbindung mit funktionellen measur ausgewertetes dann Mechanismen der Kraftproduktion und funktionelle Regeneration können die meisten werden genau identifiziert.
In dieser Hinsicht kann die Krafterzeugungsfähigkeiten eines Muskels in vitro gemessen werden, in situ oder in vivo. Alle drei Ansätze haben sowohl Vorteile als auch Grenzen. In einem in vitro Experiment, zum Beispiel, ist der Muskel vollständig isoliert und aus dem Körper des Tieres entfernt. Durch Entfernen der Einflüsse der Blutgefäße und Nerven, die den Muskel versorgen kann die Kontraktionsfähigkeit des Gewebes in einer streng kontrollierten äußeren Umgebung bestimmt werden 35. In situ Muskeltest ermöglicht es dem Muskel isoliert werden, wie mit in vitro Präparate jedoch die Innervation und Blutversorgung bleiben intakt. Der Vorteil der in situ experimentelles Modell ist , dass es ein einzelner Muskel ermöglicht sucht werden , während der Innervation und Blutversorgung minimal 36 gestört wird. Sowohlin vitro und in situ Experimenten pharmakologische Behandlungen angewendet mehr direkt für die Auswirkungen von umgebenden Gewebe oder die Auswirkungen des Kreislaufsystem auf den gemessenen kontraktilen Reaktionen ohne werden 37 zu berücksichtigen. Jedoch Tests in vivo – Funktion, wie hierin beschrieben, ist die am wenigsten invasive Technik zur Bewertung der Muskelfunktion in seiner nativen Umgebung 38, und kann wiederholt über die Zeit (dh in Längsrichtung) durchgeführt werden. Als solches wird es unter dem Mittelpunkt der Diskussion.
In dieser Hinsicht perkutane Elektroden nahe dem Muskel von Interesse eingeführt wird, oder der motorischen Nerven dass sie dient, liefern ein elektrisches Signal an den Muskel. Ein Wandler misst dann die resultierende Länge oder Kraftänderungen in dem aktivierten Muskel, wie durch eine vorgegebene, individuelle Softwareprotokoll gerichtet. Aus diesen Daten können die physikalischen Eigenschaften des Muskels zu bestimmen. Dazu gehören fürce-Frequenz, maximale Tetanus, Kraft-Geschwindigkeit, Steifigkeit, Länge Spannung und Müdigkeit. Muskellänge oder Kraft kann auch konstant gehalten werden, so dass der Muskel isometrisch oder isotonisch. Wichtig ist, dass diese experimentellen Protokolle schnell durchgeführt werden, leicht wiederholt und Kundenspezifische- alle während das Tier anästhesiert und mit einer Erholungszeit von Stunden bis Tagen. Ein einzelnes Tier kann in vivo Krafttest mehrmals durchlaufen, so dass Langzeitstudien von Krankheitsmodellen oder die Bewertung der therapeutischen Plattformen / Technologien zu ermöglichen.
Wie hier beschrieben, ist ein handelsübliches Muskelhebelsystem in Verbindung mit einer hohen Leistung, Bi-Phasen – Stimulator auszuführen in vivo Muskelfunktionstest verwendet , um den Beitrag des Tibialis anterior – Muskel der Ratte hindlimb zu Dorsalflexion des Fußes über die Anregung zu bewerten von die peroneus. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das speziell entwickelt wurde, die regenerative Medizin / ti zu bewertenUSGABE Engineering-Technologien für Muskelreparatur nach einer traumatischen Verletzung VML der Ratte TA Muskel. Es sollte notiert werden; müssen die EDL und HL aus dem vorderen cruris Raum um seziert werden , um den TA Muskel (sie machen etwa 15-20% des gesamten tibialis anterior Drehmoment gemessen folgende peroneal Nervenstimulation (Corona et al., 2013) , um speziell zu bewerten ). Da dieser Ansatz umfassende Längsschnittanalyse der Muskelphysiologie / Funktion bietet, kann es 39 wichtige mechanistische Einblicke in zahlreiche andere Arten von physiologischen Untersuchungen sowie eine Vielzahl von Krankheiten oder therapeutischen Bereichen zu vergießen. Zum Beispiel bei der Prüfung vivo Muskelfunktion ist für Untersuchungen in der Sportphysiologie, Ischämie / Reperfusion Forschung, Myopathie, Nervenschäden / Neuropathie und Vaskulopathie, Sarkopenie und Muskeldystrophien 40.
Dieses Protokoll zeigt eine relativ einfache Methode zur in vivo Muskelfunktionstest an der vorderen crural Kompartiment der Ratte hindlimb durchführt. Andere Formen der Muskelfunktionstests, einschließlich ex vivo und in situ – Protokolle können auch wichtige Informationen über Muskelphysiologie bereitzustellen. Allerdings liegt die Bedeutung der in vivo Funktionsprüfung in seiner nicht – invasiven Natur und der Tatsache , dass es am genauesten endogene Mechanismen der Muskelstimulation rekapituliert. Sowohl für ex vivo- und de – situ – Tests, der Sehne und / oder Muskel ausgesetzt sind, und deshalb muss feucht oder unter Wasser 41,42 gehalten werden. In vivo – Tests entfernt Störvariablen des Traumas und Entzündung , die durch die chirurgische Eingriffe verursacht werden kann erforderlich für in situ Muskelfunktionsprüfung; Dies ist besonders wichtig, wenn das Ziel des Versuchs ist, inflammatorischen und zelluläre Prozesse zu untersuchen, <sbis> 43. Außerdem ist in vivo – Tests erfordert wenig chirurgische Fähigkeiten als der Muskel nicht von seiner Umgebung isoliert ist und erfordert keine präzise Knoten Muskel / Sehnen – Schlupf zu reduzieren (wie es der Fall für die in situ oder ex – vivo – Tests) 41. Darüber hinaus mit ausreichender Praxis, die Geschwindigkeit der korrekten Platzierung der Elektroden und die Fähigkeit, schnell Anpassungen vornehmen maximale Kraftproduktion des Muskels zu erreichen , wird das Protokoll Abschluss ist schnell und sicher , sowohl innerhalb Tieren und in den verschiedenen Nutzern der gleichen Ausrüstung reproducible- 39 . Es ist vorteilhaft, mit einer Bewertung des gesamten vorderen crural Komponente zu beginnen, wie dargestellt, vor der Entfernung der weniger zugänglich synergistische Muskeln (EDL und HL) für eine direktere Untersuchung der TA Muskel. Mit diesem Ansatz kann man recht schnell die Beherrschung der Technik erreichen. Während die beschriebene Prozedur hier demonstriert und unterstreicht die Nützlichkeit einer Kraft frequency Protokoll Tetanus zu induzieren und die maximale Kraft bestimmen, durch einen Muskel erzeugt, sollten Anwender die Art (en) von Funktionstests ermitteln, die am besten zu ihren spezifischen Experiment informieren würde (n) und Forschungsziele.
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die sorgfältig in Reihenfolge durchgeführt werden sollten optimale und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse zu gewährleisten, das heißt, konsistente maximale Kraft-Produktion durch den Muskel zu einer Vielzahl von Stimulationsparameter. Einige der wichtigsten Merkmale sind in Abbildung 2 dargestellt. Doch die richtige Platzierung und Stabilität der Stimulationselektrode ist eine unabdingbare Voraussetzung für eine reproduzierbare maximale Stimulation des Nervus peroneus. In dieser Hinsicht sollten die Elektroden oberflächlich angebracht werden. Das heißt, wenn die Elektrodenplatzierung zu tief ist, eine direkte elektrische Stimulation der antagonistischen Muskeln Risiken, wodurch die Größe der beobachteten kontraktile Antwort des vorderen crural Raum abnimmt. Ferner ist diezwei Elektroden sollten in so nahe beieinander wie möglich angeordnet werden, um den elektrischen Widerstand der umgebenden Haut und des Bindegewebes zu reduzieren. Im Allgemeinen Elektrodenpositionierung der Nähe des Knies und medial am Bein direkt den Rand des tibialis anterior Tracing, wo sie erfüllt die gastrocnemius ergibt oft eine ausreichende Kraftproduktion. Dies stellt auch sicher, dass die Elektroden benachbart und senkrecht zu der Ebene des Nervs peroneal angeordnet sind, die wiederum an der Tibia verläuft senkrecht und seitlich in den Beinen vom Knie. Allerdings erfordert die natürliche Variabilität in der Anatomie zwischen Tieren ständige Wachsamkeit, dass die Elektrodenplatzierung, um sicherzustellen, von Fall zu Fall optimiert ist. Als solches gibt es ein gewisses Maß an Versuch und Irrtum mit Elektrodenplatzierung zugeordnet ist, die wesentlich von der Erfahrung des Benutzers verringert wird. Die Anzahl der Male die Elektroden durchdringen die Haut sollte Schwellungen und Entzündungen zu reduzieren, minimiert werden, was mir abnimmtasured Kraftproduktion. Dies ist abhängig von wo die Nadeln zunächst gestellt werden, aber es wird empfohlen, um die Nadeln zwei Mal oder weniger vor allem im Bereich bewegen rund um die Kniescheibe. Schließlich, nachdem die Elektroden in dem Bein des Tieres angeordnet sind, kleinere Anpassungen können durch die Elektroden zu liefernde die Positionierung des Beins und dem Strom durchgeführt werden. Dies sollte gleichzeitig durchgeführt werden, während die aus einer einzigen Zucken erzeugte Kraft zu überwachen. Neben der Platzierung der Elektroden können Anpassungen auch an die an die Elektroden geliefert Spannung vorgenommen werden. Allerdings ist hier beschrieben im Setup ist es wichtig, vorsichtig zu sein, wenn die Spannung als eine Möglichkeit, steigende Kraftabgabe zu erhöhen, da die erhöhte Spannung die Nerven innervate Antagonist Muskeln, die anregen wird.
Es gibt drei wichtige technische Bedenken, die gewährleisten, überwacht werden muss, dass die Platzierung der Elektroden optimal bleibt. Erstens muß der Fuß des narkotisierten Tier sein festverankert Vorrichtung mit dem Fußpedal, das die Muskelkraft Produktion (Abbildung 2) misst. Wenn der Fuß nicht fest verankert ist, kann nicht vollständig auf den Kraftaufnehmer übersetzt die wahre Kraft, die durch den Muskel produziert. Instabile Fußfixierung führt auch das Risiko für die optimale Platzierung der Elektroden als Bewegung über die normale Muskelkontraktion zu verlieren (dh der Fuß sich von der Bodenplatte entfernt) kann Verschiebung der Elektroden aus ihrer oberflächlichen Position verursachen oder sie vollständig entfernen. Entweder Szenario wird die gemessene Kraft zu verringern. Zweitens sollte dem Körper des Tieres vollständig Rücken sein und in einer geraden Ebene (Abbildung 2) ausgerichtet ist . Die richtige Positionierung des Tierkörpers verhindert leichte Bewegungen des Beins aufgrund der Atmung, und minimiert auch ein Verdrehen des Beines und des Beckens, eine bessere Platzierung und kontinuierlichen Kontakt der Stimulationselektroden ermöglicht. Drittens, die korrekte Positionierung und Verankerung des Knies ist kritical, um sicherzustellen, dass das Bein steady bleibt und somit hilft, die optimale Positionierung der Stimulationselektroden stabilisieren konsistente Aktivierung des peroneal Nerv zu ermöglichen.
Es gibt ein paar zusätzliche Punkte, die hervorgehoben werden sollen. Zuerst wird der kommerzielle Muskelhebelsystem bei Prüfung auf dem linken Bein durchzuführen, aber der Aufbau modifiziert werden kann, als auch Tests auf dem rechten Bein durchzuführen. Zweitens Muskelhebelsysteme basierend auf der Größe des Tieres gewählt werden, so dass die Nutzer sollten sicherstellen, dass die Plattform angemessen ist die Kraft, die durch das Tiermodell der Wahl zu messen und zu unterstützen. Prüfbare Muskeln für die Ausrüstung Plattform sind auf diejenigen beschränkt, die plantar Verlängerung oder Dorsalflexion des Fußes induzieren. Drittens sollte es erneut zu betonen, dass die Elektrodenplatzierung kann eine Herausforderung sein und erfordert Geduld und Übung, die Technik zu beherrschen. Die Elektroden auch stumpf werden schnell bei regelmäßiger Anwendung, so ist es hilfreich, mehrere Ersatz s zu habenets für einmal wird es schwierig, die Haut oberflächlich zu stechen. Drittens nutzt das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen spezifischen Stimulationssequenzen und Datenanalyseverfahren. Der Muskel Hebelsystem Steuerungssoftware und Datenanalyse-Software und die Daten, die sie bietet viele andere experimentelle Fragestellungen und damit zu beantworten, seinen Nutzen erstreckt sich über was hier skizziert ist. Als solche werden die Benutzer aufgefordert über die Grenzen des Softwareprotokolls (e) dargestellt in diesem Papier zu erkunden. Trotz dieser geringen Einschränkungen, in vivo Tests Muskelfunktion ist ein leistungsfähiger Ansatz , um die Gesundheit und die Kontraktionsfähigkeit des Skelettmuskels , um zu bestimmen , da sie minimal invasiv ist und kann mehrmals durchgeführt werden, über einen längeren Zeitrahmen, auf dem gleichen Tier. Kurz gesagt, diese Art der zu wartenden Nutzen macht das System besonders geschickt darin, die Auswirkungen von neuen Therapien für Skelettmuskelverletzungen oder Krankheit in der Ratte hindlimb testen.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
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VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
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Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |