Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.
Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3‘s four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants’ levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.
Short-range (tandem) alternativ splejsning, hvor alternative acceptor eller donorsteder er i tæt nærhed af hinanden, er almindelig i pattedyr 1, hvirvelløse dyr 2 og planter 3. Det anslås, at 20% af mammale gener indeholder alternative splejsningssteder 2-12 nukleotider Apart 4. Mange af disse steder er 3 nukleotider fra hinanden og resultere i optagelse eller udelukkelse af en enkelt codon. Der er debat om karakteren af splejsning regulering på disse steder 5,6 med nogle argumentere at splejsning motiv forskellene er så subtile, at valget er stokastisk 7, mens andre udlede regulering baseret på vævsspecificitet 8.
Tandem splejsningssted udvælgelse er blevet analyseret semikvantitativt ved hjælp modificeret kapillarelektroforese 7, og høj opløsning gelelektroforese 8. RNA-Seq (RNA-sekventering) læser kan bruges til at kvantificere de splejsning nøgletal på hvert splejsningsite. På denne måde har RNA-Seq data givet indsigt i reguleringen af tandem splejsningssteder 9. Det har også gjort det muligt forudsigelse af forventede splejsningsvariant nøgletal baseret på nukleotid motiv 10. Det meste af vægten på splejsning, der omfatter eller udelukker en enkelt codon har været på de mere almindeligt forekommende tandem acceptor splejsningssteder, kendt som NAGNAGs (hvor N = ethvert nukleotid).
Tandem donor alternative splejsningssteder herunder eller eksklusive en enkelt codon (GYNGYN anerkendelse motiv, hvor Y = pyrimidin) er mindre udbredt end tandem acceptorer. Signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) er et centralt gen undergår tandem donor alternativ splejsning 1,11. De tandem donor splejsningssites slutte exon 21 og 22 og resultere i optagelse eller udelukkelse af codon for serin-701 (S eller AS henholdsvis) 1,11. Downstream alternative acceptor sites (40 nukleotider fra hinanden) sammenføjning exon 22 og23a / b resultat i optagelsen af enten 55 terminale rester i transaktiveringsdomænet (α) eller en trunkeret transaktiveringsdomæne med 7 unikke C-terminale rester (p) 11. Derfor fire splejsningsvarianter er mulige.
STAT3 protein er en transkriptionsfaktor og større signal integrator i talrige celletyper 12 og når muteret sin konstitutiv aktivering bidrager til flere cancer fænotyper (gennemgået i henvisning 13). Job syndrom, en immundefekt lidelse karakteriseret ved høje niveauer af IgE, er også forårsaget af mutationer i STAT3 (revideret i henvisning 14). Adskilte roller for STAT3 α og β splejsningsvariant proteiner er blevet beskrevet tidligere 15. Oprindeligt var STAT3 β tænkt til at handle i en dominerende-negativ måde 16, antagonisering STAT3 α s transkriptionel aktivitet, men efterfølgende arbejde foreslog det har uafhængige målgener 17 </sop>. På trods af den subtilitet af tandem splejsning, er der grund til at tro fraværet eller tilstedeværelsen af serin-701 (Ser701) påvirkninger funktion. Ikke alene er Ser701 i umiddelbar nærhed af Tyrosin-705 (resten phosphoryleret i STAT3-aktivering 18), men en nylig undersøgelse viser, at STAT3 S og AS splejsningsvarianter både er nødvendige for levedygtighed af STAT3-afhængige diffust storcellet B-celle lymfom (DLBLCL) celler 19. Den biologiske relevans mangler at blive udforsket. I betragtning af at splejse variant sammensætning kan påvirke funktionen, vi bestræbt os på at opdage, om forholdet var forstyrres af cytokin stimulation i eosinofiler.
Vi forsøgte oprindeligt at udforske forbindelsen mellem de to splejsningsbegivenheder ved anvendelse af PCR specifik for STAT3 α og β splejsningsvarianter, efterfulgt af spaltning af produkter med et restriktionsenzym specifikke for S splejsningsvarianter, AfeI. Densitometri af indikerede optagelse af Ser701 var rdigt ti gange hyppigere end udeladelsen (AS) i begge STAT3 α og β (data ikke vist). Men denne semikvantitative fremgangsmåde var ikke tilstrækkeligt reproducerbar, og kunne ikke anvendes effektivt til at måle alle fire splejsningsvarianter samtidigt. For at analysere andele af hver af de fire splejsningsvarianter, var det nødvendigt at etablere en kvantitativ PCR (qPCR) protokol, gav stramme tekniske (flere assays af en given prøve) replikater.
Relativ qPCR bygger på sammenligning af et gen af interesse til en standard eller housekeeping-genet vides at blive udtrykt på et bestemt niveau 20 og er passende, når genet af interesse og husholdning gen amplificeres med samme effektivitet. En dobbeltstrenget (ds) DNA-bindende fluorescerende (cyanin) farvestof binder til PCR amplikoner 21, og efter et vist antal cyklusser, har tilstrækkelig forstærkning forekommet for fluorescens er detekterbar. Jo højere det oprindelige niveauaf transkriptet, jo lavere tærskel cyklus (Ct) værdi. Da koncentrationen af cDNA præparater varierer, er man nødt til at sammenligne udskriften koncentration med koncentrationen af en udskrift kendt for at blive udtrykt på et ensartet niveau i alle prøver, ligesom glucuronidase-β (GUSB) i eosinofiler 22.
Relativ qPCR ikke er muligt for stærkt lignende sekvenser, som det ses i splejsningsvarianter følge af tandem splejsning. De strenge betingelser specifik opformering splejsningsvarianterne resultere i nedsat effektivitet. I stedet må absolut kvantificering anvendes 23. Dette indebærer at udarbejde en standardkurve med kendte koncentrationer af den splejsede udskrift af interesse, og som sikrer PCR betingelser optimere specificitet 24. Som beskrevet, kan absolutte og relative qPCR data for et bestemt gen slås sammen til at informere forståelsen af genets ekspression i en bestemt celletype, idette tilfælde STAT3 i forskellig stimulerede eosinofiler 25.
Heri STAT3 splejsningsvariant kvantificering beskrevet med forventningen om, at fremgangsmåden kan tilpasses til målrettede studier af andre tandem splejsningsbegivenheder. Optimering var en langvarig proces, hvor flere primerpar i forskellige koncentrationer og talrige gentagelser af cykling parametre blev testet i løbet af et par måneder. De vigtigste elementer i protokollen er primer specificitet validering og kvantificering baseret på standard kurver med kendte koncentrationer af splejsningsvarianter. Relativ qPCR sammenholdt vist sig nyttig for vores ansøgning, men er ikke nødvendigt.
Vi udviklede denne protokol for at vurdere niveauet og proportioner STAT3 splejsningsvariant udskrifter i eosinofiler og lymfomceller og lære om cytokin stimulation påvirket niveauer og proportioner. STAT3 er af særlig interesse på grund af sin pleiotropisk og usikker funktionalitet, med modstridende rapporter om, hvorvidt det virker som en oncoprotein eller tumor suppressor i kræft (revideret i henvisning 33). Forskelle i STAT3 α og β splejsningsvariant funktion var blevet karakteriseret tidligere 34,35, og vores protokol lettet en knock-down / re-ekspressionsanalyse som antyder et behov for et optimalt forhold mellem S og AS afskrifter 19.
Nøjagtig kvantificering af forskellige splejsningsvarianter vil lette yderligere undersøgelser at forholde heterogene STAT3 funktion til at splejse variant sammensætning. Protokollen integrerer absolutte og relative qPCR data kombinere evne absolut qPCR at beregne splejsningsvariant proportioner, og relativ qPCR at måle ændringer i den samlede STAT3 ekspression. Denne fremgangsmåde gør det muligt at skelne små forskelle i sekvens og samtidig måle splejsning forhold på to alternative splejsningssteder mere end 50 nukleotider fra hinanden. Bestemmelse af forholdene mellem splejsningsbegivenheder enkeltvis ville ikke have givet den bemærkelsesværdige opdagelse, at en co-splejsning skævhed eksisterede sådan, at ΔSβ er højere end forventet, hvis anvendelser af de to steder er tilfældigt splejset 25.
Kritisk, absolut qPCR med anvendelse af plasmid kalibreringskurver muliggør kvantificering (ved sub-optimal effektivitet) af splice variationer, som resulterer i meget lignende sekvenser. Vi forventer en ny subtil splejsning qPCR analysen bør tage omkring to måneder for at optimere. Vigtige trin i assay udvikling er at skabe STAT3 plasmider, der anvendes til at generere standard kurver for absolut qPCR; eksperimenteltbestemmelse af optimale primer sekvenser og cykling parametre for at sikre specificitet og reproducerbarhed; og integration af relative qPCR data fra kvantificere pan-STAT3 udtryk i forhold til GAPDH udtryk. Korrelationen af eksemplar nummer kvantificeres ved pan STAT3 versus kumulativ kvantificering (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) viser, at protokollen giver pålidelige resultater.
En advarsel af teknikken er den omfattende valideringsprocessen. Det er nødvendigt at vurdere intra-assay variation (repeterbarhed), interassay variabilitet (reproducerbarhed) og specificitet. Protokollen skitserer måder at få numeriske udgange til disse parametre. Vi anså effektivitet ≥75%, specificitet faktor ≥4, variationskoefficient (reproducerbarhed) ≤10% og Ct standardafvigelse (repeterbarhed) ≤0.2 som egnede tærskler 30. Mutationer eller deletioner i STAT3 sekvens aminosyrerne 1-690 vil ikke være discovered af denne protokol, selv om de kan påvirke splejsning nøgletal. Udskrift proportioner måske ikke være proportional med proteoform proportioner 36.
Da prøverne er forskellige udgangsmaterialer mængder af total cDNA, absolut qPCR er egnet til sammenligning kopiantal af splejsningsvarianter i en prøve, men ikke for inter-sample sammenligning medmindre kombineret med relativ qPCR under anvendelse af en etableret housekeeping-gen. Den beskrevne fremgangsmåde i overensstemmelse med MIQE qPCR retningslinjer for reproducerbarhed 30. PCR cykling parametre og primerkoncentrationer muligvis modificeres til opnåelse af reproducerbare data, hvis der anvendes andet udstyr. Perfekt specificitet er ikke mulig uden drastisk at kompromittere effektivitet, men målet blev amplificeret mere effektivt med mere end fire af størrelsesordener.
Lineært DNA lettere amplificeret end cirkulær. Hvis en alternativ plasmid ikke giver tilfredsstillende standard kurver (R 2 <; 0,95), overveje linearisering plasmidet ved en enkelt websted begrænsning før kvantificering. Optimering qPCR er afgørende for at opnå data af god kvalitet (Fig 1). De fleste qPCR-protokoller er afhængige af to-trins cykling, og maskinerne er optimeret i overensstemmelse hermed. Ikke-ensartet opvarmning af varmeblokken kan forværres i tre-trins cykling, bidrager til dårlig repeterbarhed. Analyser skal sættes op under sterile forhold med filter pipettespidser og ultrarent vand, helst i en dedikeret laminar flow hætte. Fordi forureninger kan føre til forskellige resultater, bør fastsættes analyser op under sterile forhold med filter pipettespidser og ultrarent vand, helst i en dedikeret laminar flow hætte. For mere information om qPCR optimering Se Bustin et al. 32
Kvantificering STAT3 kan føre til større indsigt i en række sammenhænge. STAT3 automatisk regulerer sit eget udtryk 37, og den ovenfor beskrevne protokol kan hjælpeat belyse, om forhold mellem STAT3 splejsningsvarianter bidrager til at regulere denne positive feedback-sløjfe. Protokollen kan bruges til at studere ændringer i splejsningsvariant forhold som observeret i celler ved forskellige densiteter 38 eller i løbet af udvikling: det er kendt, at STAT3 α / β-forholdet ændringer på proteinniveauet under hæmatopoiese 16. Sundin et al. fundet, at en intron enkelt-nukleotid polymorfisme forudindtaget splejsning af exon 12 i STAT3 af en patient med Job syndrom 39. Det er tænkeligt, at en af de mange SNPs stede i intronerne mellem exon 21 og 22, eller exon 22 og 23 kan bidrage til splejsning forhold af AS / S og α / β hhv. Assayet kan anvendes til at kvantificere STAT3 transkripter i kræftceller, hvor mutationer eller ændringer i splejsning regulering kan introducere forspænding til splejsning processen 40. Mutationer i splejsningsfaktorer (ligesom SF3B1), som observed i myelodysplastisk syndrom 41 kan også føre til ændringer, der kan måles ved denne protokol.
Mere generelt, denne tilgang registrerer specifikt co-forening i splejsning, som ikke er mulig med konventionelle RNA-Seq eller standard qPCR. Mens fænomenet gensidigt udelukkende exon splejsning demonstrerer koordinering af splejsning beslutninger, co-sammenslutning af andre splejsningsbegivenheder er ikke veldokumenterede. En nyligt beskrevet alternativ fremgangsmåde, ved hvilken RNA-Seq blev modificeret for således at forespørge fuldlængde-cDNA, tyder fjernt splejsningsbegivenheder er mere co-afhængig end tidligere antaget 42.
STAT3 indeholder en donor tandem splejsningssted. Acceptor tandem splejsningssites er hyppigere 43 og principperne i den skitserede protokol kunne tjene som udgangspunkt for udvikling af assays til tilfældighed detektion af NAGNAG splejsning og andre splejsningsbegivenheder inden for 200 nukleotider. Andre Potentielle applikationer omfatter kvantificering af sammenfald af andre subtile sekvensforskelle, ligesom indels eller dobbelt / tredobbelt nukleotid polymorfier 44.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende National Institutes of Health-NHLBI til Programmet Project Grant på rolle Eosinofile i Airway Inflammation og Remodeling: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), og University of Wisconsin Carbone Cancer Center og Institut for Medicin for intramuralt finansiering. Vi takker Douglas Annis til kloning de fire STAT3 varianter.
MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
NheI | New England Biosciences | R0131S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |