Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia
Summary
RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Introduction
Proteínas de ligação a ARN (RBPs) representar cerca de 10% de S. proteínas cerevisiae 1,2 e cerca de 15% de proteínas de mamífero 3-5. Eles estão envolvidos em muitos processos celulares, tais como processamento de mRNA pós-transcricional e regulação, tradução, biogênese do ribossomo, tRNA aminoacila�o e modificação, a remodelação da cromatina, e muito mais. Um subgrupo importante de RBPs é as proteínas de ligação ao ARNm (mRNPs) 6,7. No decurso da maturação do mRNA, diferentes RBPs ligar a transcrição e mediar a transformação nuclear, exportação para fora do núcleo, a localização celular, tradução e degradação 6-8. Assim, o conjunto distinto de RBPs ligados a um transcrito particular, a qualquer ponto de tempo determina o seu processamento e em última análise o seu destino.
A identificação de RBPs associados a um mRNA poderia melhorar significativamente a nossa compreensão dos processos subjacentes à sua regulação pós-transcricional. Diverse genética, Métodos microscópicos, bioquímicos e de bioinformática têm sido utilizados para identificar proteínas envolvidas na regulação do ARNm (revisto em 9-11). No entanto, apenas alguns desses métodos permitem a identificação de proteínas associadas a um ARNm alvo particular. Digno de nota é o sistema híbrido de levedura Três (Y3H), que utiliza o mRNA de interesse como isca para pesquisar uma biblioteca de expressão em células de levedura. Os clones positivos são observados geralmente através de uma selecção de crescimento ou repórter expressão 12-14. A principal vantagem deste método é o grande número de proteínas que podem ser digitalizados num ambiente celular e a capacidade para medir a força da interacção RNA-proteína. Desvantagens incluem o número relativamente grande de resultados falsos positivos devido à ligação não específica, eo alto potencial de resultados falsos negativos devido, em parte, a misfolding da presa proteína de fusão ou o RNA isca.
Uma alternativa à abordagem genética é purifi afinidadecatião de ARN com as suas proteínas associadas. Poli A contendo ARNm pode ser isolado através da utilização de colunas de oligo dT, e as suas proteínas associadas são detectados por espectrometria de massa. A interacção RNA-proteína é conservado no seu contexto celular por reticulação, o que faz com que as ligações covalentes de curto alcance. A utilização da coluna de oligo dT proporciona uma visão global de todo o proteoma que está associado com qualquer poli A de mRNA contendo 3,5,15. No entanto, este não fornece uma lista de proteínas que estão associadas com um ARNm específico. Muito poucos métodos estão disponíveis para realizar uma tal identificação. O método implica a transfecção PAR de ácido nucleico com complementaridade com o mRNA alvo 16,17. O ácido nucleico está também ligado a um péptido, o que permite a reticulação de RBPs em estreita proximidade ao local de interacção. Após a reticulação, o ácido nucleico RBP-péptido pode ser isolado e submetido a análise proteómica. Recentemente, uma metodologia baseada na aptâmero eraaplicado com sucesso a extractos de linhas de células de mamíferos 18. Um aptâmero de ARN com afinidade melhorada para estreptavidina e foi desenvolvido fundido com uma sequência de interesse (elemento ricos em AU (ARE), neste caso). O ARN aptâmero-ARE foi ligado a esferas de estreptavidina e misturados com o lisado celular. As proteínas associadas a que a sequência são foram purificados e identificados por espectrometria de massa (MS). Embora este método detectado associações que ocorrem fora das definições celulares (isto é, in vitro), é susceptível de ser modificado no futuro, de modo a introduzir os aptâmeros no genoma e, assim, permitir o isolamento de proteínas associadas com o ARNm enquanto que na meio celular (isto é, in vivo). Em leveduras, onde manipulações genéticas estão bem estabelecidos, o método rápido (desenvolvido no laboratório do Prof. Jeff Gerst) fornece uma visão in vivo associações 19. Rápida combina o específico e forte ligação da proteína de revestimento de MS2 (MS2-CP) para a sequência de ARN MS2, e do domínio de ligação a estreptavidina (SBP) a estreptavidina esferas conjugadas. Isso permite a purificação eficiente de mRNAs MS2-marcadas através de contas de estreptavidina. Além disso, a expressão de 12 cópias de MS2 laços permite até seis MS2-CPS de se ligar simultaneamente para o RNA e aumentar a eficiência do seu isolamento. Este protocolo foi, portanto, sugerida para permitir a identificação de novas proteínas associadas à ARNm uma vez que as amostras eluídas são sujeitas a análise por espectrometria de massa proteómica.
Recentemente, utilizou rápido para identificar novas proteínas associadas com a levedura Pmp1 ARNm 20. Pmp1 ARNm foi anteriormente mostrado para ser associado com a membrana do RE e do seu 3 'não traduzida (UTR) foi encontrado para ser um dos principais determinantes nesta associação 21. Assim, RBPs que se ligam Pmp1 UTR 3 'são susceptíveis de desempenhar um papel importante na sua localização. Rápida seguida de cromatografia líquiday-espectrometria de massa / espectrometria de massa (LC-MS / MS) resultou na identificação de várias novas proteínas que interagem com Pmp1 20. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado da metodologia rápida, controles importantes que precisam ser feitas, e dicas técnicas que podem melhorar o rendimento e especificidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários métodos utilizam o isolamento de ARNm específicos para identificar as suas proteínas associadas 11,34 35. Estes métodos aplicam-se in vitro e in vivo em estratégias para investigar interacções ARN-proteína. Métodos in vitro incubar exogenamente ARN transcrito com lisado celular para capturar RBPs e isolar complexos de RNP 36,37. Uma abordagem eficaz deste tipo foi apresentado recentemente, o que permitiu a identificação de novas proteínas qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin para os seus conselhos úteis na criação do protocolo rápida e fornecendo os plasmídeos necessários. Agradecemos também a Dr. Abigail Atir-Lande por sua ajuda no estabelecimento deste protocolo e Dr. Tamar Ziv do Smoler Proteomics Center for sua ajuda com a análise LC-MS / MS. Agradecemos Prof. TG Kinzy (Rutgers) para o anticorpo YEF3. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2011013 do Binacional Science Foundation.
Materials
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
Referências
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3′-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward–one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
