急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離
Summary
RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Introduction
RNA結合タンパク質（RBPs）はSの約10％を占めセレビシエタンパク質1,2および哺乳動物タンパク質3-5の約15％。これらは、mRNAの転写後プロセシングおよび調節、翻訳、リボソーム生合成、tRNAのアミノアシル化と修正、クロマチンリモデリング、およびより多くのような多くの細胞プロセスに関与しています。 RBPsの重要なサブグループは、mRNA結合タンパク質（mRNPs）6,7です。 mRNAの成熟の過程において、異なるRBPsは、転写物と結合し、その核処理、核のうち輸出、細胞内局在、翻訳および劣化6-8を媒介します 。したがって、任意の時点で特定の転写産物に結合しているRBPsの別個のセットは、その処理し、最終的にその運命を決定します。
mRNAと関連RBPsの識別が大幅に転写後調節の基礎をなす過程の理解を向上させることができます。遺伝的多様顕微鏡、生化学およびバイオインフォマティクス方法は、（9-11に概説）mRNAの調節に関与するタンパク質を同定するために使用されてきました。しかしながら、これらの方法のほんの数は、特定の標的mRNAと関連するタンパク質の同定を可能にします。注目すべきは、酵母細胞における発現ライブラリーをスクリーニングするために餌として関心のmRNAを利用した酵母スリーハイブリッドシステム（Y3H）、です。陽性クローンは、通常の成長の選択またはレポーター発現12-14を通して観察されます。この方法の重要な利点は、細胞環境およびRNA-タンパク質相互作用の強さを測定する能力に走査することができる多数のタンパク質です。欠点は、融合タンパク質の餌または餌RNAのミスフォールディングに、部分的に、非特異的結合に起因する偽陽性の結果の比較的大きい数、により偽陰性の結果のために高い可能性を含みます。
遺伝的アプローチに代わるものは親和性purifiですその関連タンパク質とRNAのカチオン。ポリAを含むmRNAは、オリゴdTカラムの使用によって分離することができ、およびそれらの関連タンパク質は、質量分析によって検出されます。 RNA-タンパク質相互作用は、短距離共有結合を作る架橋によってその細胞コンテキストに保存されています。オリゴdTカラムの使用は、任意のポリA-含むmRNA 3,5,15に関連付けられているプロテオーム全体のグローバルな視点をもたらします。しかし、これは、特定のmRNAに関連付けられているタンパク質のリストを提供していません。非常に少数の方法は、このような識別を達成するために利用可能です。 PAIRの方法は、標的mRNAの16,17に対する相補性を有する核酸のトランスフェクションを伴います。核酸はまた、相互作用部位に近接してRBPsに架橋可能ペプチドに付着されます。架橋後、RBP-ペプチド核酸を単離することができ、プロテオミクス分析に供しました。最近、アプタマーベースの方法論がありました正常哺乳動物細胞株18からの抽出物に適用されます。ストレプトアビジンへの改善された親和性を有するRNAアプタマーを開発し、（この場合はAUリッチエレメント（ARE））目的の配列に融合させました。アプタマーARE RNAをストレプトアビジンビーズに付着し、細胞溶解物と混合しました。 ARE配列に関連するタンパク質を精製し、質量分析（MS）により同定しました。この方法は、細胞の設定（ すなわち 、 インビトロ ）の外側に発生する関連付けを検出しているが、mRNAに関連するタンパク質の単離をゲノムにアプタマーを導入し、従って、可能なように、将来的に修飾される可能性が高いにある間細胞環境（ すなわち 、in vivoで ）。遺伝子操作は、十分に確立された酵母では、（教授ジェフGerstの研究室で開発された）迅速法は、in vivo団体19のビューを提供します。ラピッド（MS2コートタンパク質の特異的かつ強力な結合を兼ね備えMS2-MS2 RNA配列に、ストレプトアビジン結合ドメイン（SBP）のストレプトアビジン結合ビーズにCP）。これは、ストレプトアビジンビーズを介してMS2-タグ付けされたmRNAの効率的な精製を可能にします。また、MS2は、ループの12のコピーの発現は、RNAに同時に結合し、その分離の効率を高めるために6 MS2-のCPまで使用できます。このプロトコルは、従って、溶出された試料を質量分析によってプロテオミクス分析に供された後、新規のmRNA結合タンパク質の同定を可能にするために示唆されました。
我々は最近、酵母PMP1 mRNAを20に関連付けられた新規タンパク質を同定するための迅速を利用した。PMP1 mRNAが以前にER膜と関連することが示され、その3 '非翻訳領域（UTR）は、この関連21の主要な決定要因であることが判明しました。したがって、PMP1 3 'UTRに結合RBPsその局在に重要な役割を果たす可能性があります。 RAPIDは、液体クロマトグラフが続きますY字型質量分析/質量分析（LC-MS / MS）は、PMP1 20と相互作用する多数の新規タンパク質の同定をもたらしました。ここで、我々は急速な方法論、実行する必要がある重要なコントロール、および収量と特異性を向上させることができる技術的なヒントの詳細なプロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
様々な方法は、関連するタンパク質11,34 35を識別するために、特定のmRNAの単離を使用します。これらの方法は、RNA-タンパク質相互作用を調べるために、in vitroおよびde vivo戦略に適用する。 インビトロ方法は、外因RBPsを捕捉し、RNP複合体36,37を単離するために細胞溶解物を用いてRNAを転写インキュベートします。このタイプの効果的?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、迅速なプロトコルを設定し、必要なプラスミドを提供することで、それらの有益な助言のための教授ジェフGerstとボリスSlobodinに感謝します。また、LC-MS / MS分析と彼女の助けをSmolerプロテオミクスセンターからこのプロトコルと博士タマルジブを確立する上で彼女の助けのために博士Avigail ATIR-ランデに感謝します。我々はYEF3抗体について教授TG Kinzy（ラトガーズ）をお願いいたします。この作品は、国間科学財団からの助成金2011013によってサポートされていました。
Materials
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
Referências
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