رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية
Summary
RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Introduction
البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) تمثل حوالي 10٪ من س. بروتينات خميرة 1،2 وحوالي 15٪ من البروتينات الثدييات 3-5. كانوا متورطين في العديد من العمليات الخلوية مثل معالجة مرنا بعد النسخي والتنظيم، الترجمة، نشوء حيوي الريبوسوم، الحمض الريبي النووي النقال aminoacylation وتعديل، وإعادة عرض لونين، وأكثر من ذلك. فريق فرعي هامة من الممارسات التجارية التقييدية هي بروتينات ملزمة مرنا (mRNPs) 6،7. في سياق نضوج مرنا، الممارسات التجارية التقييدية مختلفة تربط نص وتوسط معالجة النووي والتصدير من النواة، توطين الخلوية والترجمة وتدهور 6-8. وهكذا، فإن مجموعة متميزة من الممارسات التجارية التقييدية منضم إلى نص معين في أي نقطة زمنية يحدد التجهيز لها، وفي نهاية المطاف مصيرها.
تحديد الممارسات التجارية التقييدية المرتبطة مرنا يمكن أن تحسن بشكل كبير من فهمنا للعمليات التي يقوم تنظيمها بعد النسخي. تنوعا الوراثية، وقد استخدمت أساليب المجهرية، والكيمياء الحيوية والمعلوماتية الحيوية لتحديد البروتينات المشاركة في التنظيم مرنا (إعادة النظر في 11/9). ومع ذلك، سوى عدد قليل من هذه الأساليب تمكن من التعرف على البروتينات المرتبطة مرنا هدف معين. من المذكرة هو الخميرة ثلاثة نظام الهجين (Y3H)، الذي يستخدم مرنا من الفائدة كطعم لفحص مكتبة التعبير في خلايا الخميرة. وعادة ما تكون لاحظت الحيوانات المستنسخة إيجابية من خلال مجموعة مختارة النمو أو مراسل التعبير 12-14. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو وجود عدد كبير من البروتينات التي يمكن مسحها في بيئة الخلوية والقدرة على قياس قوة التفاعل الحمض النووي الريبي البروتين. وتشمل النواحي العدد الكبير نسبيا من نتائج إيجابية كاذبة بسبب غير محددة وملزمة، وقدرة عالية على النتائج السلبية الكاذبة الواجبة، في جزء منه، إلى misfolding فريسة البروتين الانصهار أو الحمض النووي الريبي الطعم.
بديل للنهج الوراثي purifi تقاربالموجبة من الحمض النووي الريبي مع البروتينات المرتبطة بها. بولي والتي تحتوي على من mRNAs يمكن عزلها من خلال استخدام جزئية الأعمدة دينارا، والكشف عن البروتينات المرتبطة بها عن طريق قياس الطيف الكتلي. يتم حفظها تفاعل الحمض النووي الريبي البروتين في سياق الخلوي من قبل يشابك، الأمر الذي يجعل الرابطة التساهمية قصيرة المدى. استخدام العمود DT بنسبة ضئيلة غلة نظرة عالمية للبروتيوم بأكمله الذي يرتبط مع أي بولي والتي تحتوي على مرنا 3،5،15. ومع ذلك، هذا لا يوفر قائمة من البروتينات التي ترتبط مع مرنا بشكل خاص. جدا متاحة لإنجاز مثل هذا تحديد عدد قليل من الطرق. يستتبع طريقة زوج ترنسفكأيشن من الحمض النووي مع التكامل إلى الهدف مرنا 16،17. ويرد الحمض النووي أيضا إلى الببتيد، والذي يسمح يشابك إلى الممارسات التجارية التقييدية في المناطق المجاورة القريبة من موقع التفاعل. بعد يشابك، وحامض الممارسات التجارية التقييدية-الببتيد النووي يمكن عزل ويتعرضون لتحليل البروتينات. في الآونة الأخيرة، وكانت منهجية القائم على أبتمرطبقت بنجاح لمقتطفات من خطوط الخلايا الثديية 18. تم وضع أبتمر RNA مع تحسين التقارب إلى streptavidin وتنصهر لسلسلة من الفائدة (عنصر والاتحاد الافريقي الغني (ARE) في هذه الحالة). كان يعلق على أبتمر-ARE RNA لحبات streptavidin ومختلطة مع المحللة الخلية. وتنقيته البروتينات التي ترتبط مع تسلسل ARE وتحديد الطيف الكتلي (MS). على الرغم من أن هذه الطريقة الكشف عن الجمعيات التي تحدث خارج الإعدادات الخلوية (أي في المختبر)، فإنه من المرجح أن يتم تعديل في المستقبل وذلك لتقديم الأبتامرات في الجينوم وتمكين وبالتالي عزل البروتينات المرتبطة مرنا أثناء وجوده في الوسط الخلوي (أي في الجسم الحي). في الخميرة، حيث يتم وضع التلاعب الجيني جيدا، وطريقة سريعة (وضعت في مختبر البروفيسور جيف Gerst) تقدم وجهة نظر في الجسم الحي الجمعيات 19. السريع يجمع بين MS2- محددة وملزمة من البروتين معطف MS2 قوي (CP) إلى تسلسل الحمض النووي الريبي MS2، والمجال ملزم streptavidin (متوسط ضغط الدم الانقباضي) لstreptavidin الخرز مترافق. وهذا يمكن تنقية فعالة لمن mRNAs الموسومة MS2 من خلال حبات streptavidin. وعلاوة على ذلك، والتعبير من 12 نسخ من حلقات MS2 يسمح ما يصل الى ستة MS2-البرامج القطرية لربط في الوقت نفسه إلى الحمض النووي الريبي وزيادة كفاءة عزلتها. ولذلك اقترح هذا البروتوكول لتمكين تحديد البروتينات المرتبطة مرنا رواية أخرى يتعرضون عينات مزال لتحليل البروتينات التي مطياف الكتلة.
نحن استخدمت مؤخرا السريع لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة الخميرة PMP1 مرنا 20 تم إظهار PMP1 مرنا سابقا لتترافق مع غشاء ER وعثر 3 'المنطقة غير مترجمة لها (UTR) أن يكون محددا رئيسيا في هذه الجمعية 21. وهكذا، الممارسات التجارية التقييدية التي تربط PMP1 3 'UTR من المرجح أن يلعب دورا هاما في توطين لها. يتبع السريع من قبل الكروماتوجرافي السائلأدى ذ الكتلة الطيفي / قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) في تحديد العديد من البروتينات الجديدة التي تتفاعل مع PMP1 20. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لمنهجية سريعة، والضوابط الهامة التي تحتاج إلى القيام به، ونصائح تقنية قد تحسين المحصول وخصوصية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أساليب مختلفة تستخدم في عزل من mRNAs محددة لتحديد البروتينات المرتبطة بها 11،34 35. وتنطبق هذه الأساليب في التجارب المختبرية واستراتيجيات الجسم الحي للتحقيق تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. في المختبر طرق احتضان نسخه خارجيا RNA مع المح…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البروفيسور جيف Gerst وبوريس Slobodin للحصول على المشورة المفيدة في إعداد بروتوكول السريع وتوفير البلازميدات اللازمة. كما نشكر الدكتور أفيغيل عتير-انديه لمساعدتها في إنشاء هذا البروتوكول والدكتور تمار زيف من مركز البروتيوميات Smoler لمساعدتها مع تحليل LC-MS / MS. نشكر الأستاذ TG Kinzy (روتجرز) للأجسام المضادة YEF3. وأيد هذا العمل من قبل منحة 2011013 من مؤسسة الثنائية للعلوم.
Materials
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
Referências
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3′-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward–one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
