से बाहरी झिल्ली Vesicles भीतर निर्देशित प्रोटीन पैकेजिंग<em> कोलाई</em>: डिजाइन, उत्पादन और शोधन
Summary
A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.
Abstract
बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMV) कार्यक्रम के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों को लागू करने में एक बढ़ती रुचि OMV के लिए कुछ बहुत ही रोचक और अद्वितीय अनुप्रयोगों जहां पारंपरिक नैनोकणों भी synthesize करने के लिए मुश्किल साबित हो रहे हैं करने के लिए नेतृत्व कर रहे हैं। तिथि करने के लिए, सभी ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया है कि छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और आनुवंशिक सामग्री शामिल कार्गो की एक किस्म के OMV प्रदर्शन पैकेजिंग उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है। उनके विविध माल के आधार पर, OMV कई जैविक सेल सेल संचार से जीन स्थानांतरण और निर्भर करता है जिस पर बैक्टीरिया OMV उत्पादन कर रहे हैं विषैलापन कारकों की डिलीवरी को लेकर प्रक्रियाओं में फंसा रहे हैं। हाल ही में बैक्टीरियल OMV तकनीकों के विकास के माध्यम से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग को नियंत्रित करने और OMV में पुनः संयोजक प्रोटीन की प्रत्यक्ष पैकेजिंग के लिए सुलभ हो गए हैं। इस प्रोटोकॉल के उत्पादन, शुद्धि के लिए एक विधि है, और एंजाइम पैक OMV के उपयोग का वर्णन करता है प्रदान करने के लिए Overa में सुधारपुनः संयोजक एंजाइम, बढ़ vesiculation, और बढ़ाया एंजाइम स्थिरता के डालूँगा उत्पादन। इस प्रोटोकॉल के सफल उपयोग के एक जीवाणु तनाव है कि एक साथ एक पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन और पुनः संयोजक प्रोटीन और एक बाहरी झिल्ली लंगर प्रोटीन के बीच एक कृत्रिम संबंध बनाने के माध्यम से OMV encapsulation के लिए यह निर्देश के निर्माण में परिणाम होगा। दवा दवा वितरण, चिकित्सा निदान, और पर्यावरण remediation: इस प्रोटोकॉल भी बैक्टीरियल संस्कृतियों के साथ ही समुचित से निपटने की तकनीक और चीजों से OMV अलग है जब इस तरह के रूप में अन्य विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल पर विचार करने के लिए तरीके का विवरण।
Introduction
यहाँ प्रस्तुत डिजाइन, उत्पादन, और एंजाइम से भरी हुई बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMV) की शुद्धि के लिए एक विधि है। OMV, proteoliposomes कि 30-200 एनएम 1,2 से आकार में सीमा छोटे, मुख्य रूप से unilamellar हैं। सभी ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया है कि तिथि करने के लिए अध्ययन किया गया है उनकी सतह 3,4 से या तो OMV या बाह्य पुटिकाओं (ईवी) की रिहाई का प्रदर्शन किया है। सटीक व्यवस्था है जिसके द्वारा OMV उत्पादित कर रहे हैं अभी तक पूरी तरह से विविध बैक्टीरियल आबादी है कि उन्हें करने के साथ ही अलग-अलग कार्य करता है कि वे सेवा छिपाना के कारण स्पष्ट किए जाने की है। OMV आनुवंशिक जटिल संकेतन, जीन स्थानान्तरण के एक किस्म की सेवा सामग्री के लिए छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, और प्रोटीन से माल की एक विस्तृत श्रृंखला के परिवहन के लिए दिखाया गया है, और डाह में कार्य 5,6।
OMV जीवजनन की सटीक तंत्र अच्छी तरह से होती नहीं कर रहे हैं, और बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच अलग दिखाई देते हैं। थी बावजूदतथ्य यह है, हम ब्याज की एक प्रोटीन और बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली के लिए एक बेहद प्रचुर मात्रा में प्रोटीन अंतर्जात और बाद OMV के बीच एक कृत्रिम संबंध बनाने के द्वारा OMV में एक पुनः संयोजक प्रोटीन की पैकेजिंग दक्षता बढ़ाने के लिए एक विधि विकसित किया है। एक कृत्रिम उठाना, या कृत्रिम रूप से शामिल समानता के अभाव में, recombinantly व्यक्त प्रोटीन और OMV के बीच मनाया पैकेजिंग क्षमता बहुत कम 7 है। यह परिणाम OMV के भीतर प्रोटीन या तो बैक्टीरियल सतह पर या निर्देशित पैकेजिंग के माध्यम से OMV गठन की सटीक पल में यादृच्छिक मौका encapsulation के माध्यम से होता है तंत्र द्वारा कि अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं के समावेश के रूप में उम्मीद की जा रही है। कुछ सफलता periplasmic जो अंतरिक्ष यादृच्छिक मौका encapsulation लेकिन प्रभावी पैकेजिंग पर निर्भर करता है के भीतर अभिव्यक्ति पर बस के माध्यम से प्रोटीन पैकेजिंग में देखा गया है अत्यधिक प्रोटीन कुछ प्रोटीन उच्च दक्षता पर निर्भर पैकेजिंग के साथ दूसरों वीं की तुलनासभी 8-10 पर पर पैकेज नहीं है। आम सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग करके हम कोलाई (ई कोलाई) एक साथ उत्पादन, पैकेज और कहा कि वर्तमान ज्ञान के बारे में कैसे OMV का गठन कर रहे हैं और कैसे कार्गो के लिए बैक्टीरिया द्वारा चुना जाता है सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न OMV में ब्याज की एक सक्रिय एंजाइम छिपाना इंजीनियर करने की मांग की पैकेजिंग।
इस आवेदन के प्रयोजनों के लिए के रूप में पसंद के सिंथेटिक लिंकेज OMV में दिशात्मक पैकेजिंग की सुविधा के लिए एक विभाजन प्रोटीन bioconjugation प्रणाली का चयन किया गया था। जैसा कि नाम से पता चलता है एक विभाजन प्रोटीन bioconjugation प्रणाली दो पूरक सबयूनिट डोमेन है कि एक दूसरे के साथ बातचीत के शामिल है। विभाजन प्रोटीन इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए चयनित डोमेन SpyCatcher (एससी) और SpyTag (अनुसूचित जनजाति) डोमेन के रूप में और स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस fibronectin बाध्यकारी प्रोटीन (FbaB) 11 से निकाली गई है करने के लिए भेजा जाता है। इस विभाजन प्रोटीन प्रणाली है कि w में असामान्य हैमुर्गी दो यूनिटों निकटता के भीतर एक isopeptide बंधन हैं अनायास एसिड और अमीनो एसिड लाइसिन एक सहसंयोजक उठाना बनाने के अवशेष aspartic समीपस्थ बीच रूपों। Isopeptide बंधन गठन निगरानी प्रोटीन, उत्प्रेरक एंजाइमों, या सहकारकों के अलावा आवश्यकता नहीं है और आसानी से कमरे के तापमान (आर टी) में और physiologically प्रासंगिक शर्तों 12 की एक विस्तृत श्रृंखला पर हो सकता है।
अवधारणा के एक सबूत के रूप में, phosphotriesterase (PTE) (ईसी 3.1.8.1) Brevundimonas diminuta से ई कोलाई निकाली गई OMV 13 में पैक किया जा करने के लिए चुना गया था। प्राइवेट एक binuclear Zn / Zn सक्रिय साइट में शामिल है और एक हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया dialkylphosphates और aryl एल्कोहल 14 में aryldialkylphosphates परिवर्तित करने के माध्यम से organophosphates नीचे तोड़ने के लिए की क्षमता है। organophosphates के संपर्क में neuromuscular जंक्शनों makin पर एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ द्वारा acetylcholine की हाइड्रोलिसिस बाधा के माध्यम से उचित न्यूरोट्रांसमीटर समारोह impairsजी organophosphate निकाली गई यौगिकों बेहद खतरनाक 15। लंबे समय तक या organophosphates के लिए महत्वपूर्ण जोखिम सामान्यतः बेकाबू आक्षेप में यह परिणाम है और आम तौर पर asphyxiation के माध्यम से मृत्यु का कारण बनता है। प्राइवेट paraoxon की ओर उच्चतम उत्प्रेरक गतिविधि दर्शाती है, वहीं एक बहुत शक्तिशाली कीटनाशक, यह भी अन्य कीटनाशकों और वी / जी प्रकार के रासायनिक तंत्रिका एजेंटों 16 के एक विस्तृत रेंज hydrolyzing में सक्षम है। OMV पैकेजिंग की सुविधा के लिए एक जीवाणु प्लाज्मिड डिजाइन किया गया था कि एक जीन का निर्माण है कि एक inducible प्रमोटर, एक periplasmic स्थानीयकरण अनुक्रम, और अनुसूचित जाति जीन अनुक्रम की नदी के ऊपर एक छोटे से कई क्लोनिंग साइट में शामिल encodes। नेता और अनुसूचित जाति अनुक्रम एक आनुवांशिक स्विच है कि OMV पैकेजिंग के लिए periplasmic अंतरिक्ष के लिए प्राइवेट अनुसूचित जाति संलयन प्रोटीन लक्ष्य के निर्माण के लिए अनुमति के बीच प्राइवेट जीन की प्रविष्टि। प्रयासों यहाँ वर्णित PTE पर ध्यान केंद्रित करते हैं, एंजाइम जीन विनिमेय है और आसानी से Fac को एक और जीन अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकताएक वैकल्पिक एंजाइम या प्रोटीन की ilitate पैकेजिंग।
सिंथेटिक लिंकेज के दूसरे भाग के रूप में, एक प्रचुर मात्रा में बाहरी झिल्ली प्रोटीन (OMPA) अनुसूचित जनजाति पेप्टाइड अनुक्रम पेश करने के लिए चुना जाता है। जबकि लंगर प्रोटीन भिन्न हो सकते हैं की पसंद है, यह जरूरी है प्रोटीन एक अनुमोदक डोमेन कि periplasmic अंतरिक्ष के भीतर प्रस्तुत करता है, cytotoxicity उत्प्रेरण बिना संलयन निर्माण बर्दाश्त, OMV में उपस्थित होने के लिए जाना जाता है, और कुल नहीं है जब यह recombinantly है उत्पादन किया। OMPA एक 37.2 केडीए transmembrane Porin प्रोटीन है कि अत्यधिक बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली और बाद OMV 17 में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है। यह छोटे अणुओं के परिवहन में फंसा है, आकार में 2 एनएम <बैक्टीरियल झिल्ली 18 के पार। मूल निवासी OMPA दो संरचनात्मक रूप से अद्वितीय डोमेन, एक transmembrane बीटा बैरल मूल भाव है और एक periplasmically घुलनशील सी टर्मिनल पेप्टीडॉग्लीकैन 19 के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता भाग है। उत्परिवर्ती OMPA-एसटी फ्यूजन तैयार बनाया गया मेंयहाँ घ OMPA के सी टर्मिनल भाग नष्ट कर दिया गया और अनुसूचित जनजाति periplasmically का सामना करना पड़ एन या सी-रोम से जुड़े हुए किया गया था। OMPA की periplasmic हिस्से को हटाना बाहरी झिल्ली और पेप्टीडॉग्लीकैन झिल्ली अस्थिरता हाइपर-vesiculation 7 के लिए अग्रणी में जिसके परिणामस्वरूप के बीच बातचीत की संख्या कम हो जाती है। जीनोमिक OMPA recombinantly व्यक्त OMPA-एसटी का निर्माण करने के अलावा बनाए रखा गया था सकल झिल्ली अस्थिरता को कम करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक प्रतिनिधि प्रदर्शित करने के लिए इस प्रोटोकॉल कार्यों पैकेजिंग तकनीक है जिसमें ब्याज की एक एंजाइम का उत्पादन किया और ई कोलाई से OMV में पैक किया जाता है का निर्देश दिया। कई जटिल तकनीक के साथ वहाँ के…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.
Materials
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS / particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
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